Metoda e Pasteur-it (metoda e hollimit kufizues). Ai konsiston në bërjen e një sërë hollimesh të njëpasnjëshme nga materiali në studim në një mjedis të lëngshëm ushqyes. Për ta bërë këtë, një pikë inokulimi futet në një epruvetë me një medium të lëngshëm steril, pika prej tij transferohet në epruvetën tjetër dhe në këtë mënyrë inokulohen deri në 8...10 epruveta. Me çdo hollim, numri i qelizave mikrobike që hyjnë në mjedis do të zvogëlohet dhe është e mundur të merret një hollim i tillë në të cilin në të gjithë epruvetën me mjedisin do të ketë vetëm një qelizë mikrobike, nga e cila do të bëhet një kulturë e pastër e mikroorganizmit. zhvillojnë. Meqenëse mikrobet rriten në mënyrë difuze në mjedise të lëngshme, d.m.th. shpërndahen lehtësisht në të gjithë mjedisin, është e vështirë të izolohet një qelizë mikrobike nga një tjetër. Kështu, metoda e Pasteur nuk siguron gjithmonë një kulturë të pastër. Prandaj, aktualisht, kjo metodë përdoret kryesisht për të reduktuar paraprakisht përqendrimin e mikroorganizmave në material përpara se të inokulohet në një mjedis të ngurtë për të marrë koloni të izoluara.

Metodat për ndarjen mekanike të mikroorganizmave duke përdorur media të ngurta ushqyese. Metoda të tilla përfshijnë metodën Koch dhe metodën Drigalski.

Metoda Koch (metoda e mbjelljes së thellë). Materiali i provës futet me një lak bakteriologjik ose me pipetë Pasteur në një epruvetë me një lëndë ushqyese të dendur të shkrirë. Përziejeni përmbajtjen e epruvetës në mënyrë të barabartë duke e rrotulluar midis pëllëmbëve tuaja. Një pikë e materialit të holluar transferohet në epruvetën e dytë, nga e dyta në të tretën, etj. Përmbajtja e secilës epruvetë, duke filluar nga e para, derdhet në enë sterile Petri. Pasi mediumi është ngurtësuar në enët, ato vendosen në një termostat për kultivim.

Për të izoluar mikroorganizmat anaerobe duke përdorur metodën Koch, është e nevojshme të kufizohet qasja e oksigjenit në kulturë. Për këtë qëllim, sipërfaqja e mbjelljes së thellë në një enë Petri mbushet me një përzierje sterile të parafinës dhe vazelinës (1:1). Ju gjithashtu mund ta lini inokulimin, të përzier tërësisht me mediumin e agarit, direkt në provëz. Në këtë rast, tapa e pambukut zëvendësohet me një gome ose sipërfaqja e agarit mbushet me një përzierje parafine dhe vazelinë. Për të nxjerrë kolonitë e rritura të mikroorganizmave anaerobe, tubat nxehen pak duke u rrotulluar shpejt mbi flakën e djegësit. Agari ngjitur me muret shkrihet dhe kolona rrëshqet lehtësisht në pjatën e përgatitur Petri. Më pas, kolona e agarit pritet me një bisturi steril, kolonitë hiqen me një lak steril ose një prestar kapilar steril dhe transferohen në një mjedis të lëngshëm.

Metoda Drigalski bazohet në ndarjen mekanike të qelizave mikrobike në sipërfaqen e një mediumi të dendur ushqyes në enët Petri. Çdo qelizë mikrobike, duke u fiksuar në një vend të caktuar, fillon të shumohet, duke formuar një koloni.

Për mbjellje duke përdorur metodën Drygalsky, përdoren disa pjata Petri të mbushura me një medium të dendur ushqyes. Një pikë e materialit testues vendoset në sipërfaqen e mediumit. Më pas, duke përdorur një shpatull sterile, kjo pikë shpërndahet në të gjithë mjedisin ushqyes (mbjellja e lëndinës).

Mbjellja mund të bëhet edhe me viza duke përdorur një lak bakteriologjik. E njëjta shpatull ose lak përdoret për të mbjellë të dytën, të tretën etj. gota. Si rregull, në filxhanin e parë pas kultivimit të farës, rritja mikrobike shfaqet në formën e një shtrese të vazhdueshme; në kupat e mëvonshme, përmbajtja e mikroorganizmave zvogëlohet dhe krijohen koloni të izoluara, nga të cilat mund të izolohet lehtësisht një kulturë e pastër me skanim. .

Kështu, në sektorët e parë, fitohet një rritje e vazhdueshme dhe përgjatë goditjeve të mëvonshme, do të rriten koloni të izoluara, që përfaqësojnë pasardhësit e një qelize.

Për të kursyer media dhe vegla, mund të përdorni një filxhan, duke e ndarë atë në sektorë dhe t'i mbillni në mënyrë të njëpasnjëshme me një brez (metoda e brezit të varfëruar). Për ta bërë këtë, merrni materialin në një lak dhe vizatoni një seri goditjesh paralele me të, së pari përgjatë sipërfaqes së sektorit të parë, dhe më pas mbillni me radhë të gjithë sektorët e tjerë me qelizat që mbeten në lak. Me çdo goditje të mëvonshme, numri i qelizave të mbjella zvogëlohet.

Metoda për izolimin e kulturave të pastra duke përdorur kimikate përdoret për të izoluar kulturat e mikroorganizmave rezistente ndaj kimikateve të caktuara. Për shembull, duke përdorur këtë metodë është e mundur të izolohet një kulturë e pastër e mykobaktereve tuberkuloze që janë rezistente ndaj acideve, alkaleve dhe alkoolit. Në këtë rast materiali në studim mbushet me tretësirë ​​acidi 15% ose antiforminë para mbjelljes dhe mbahet në termostat për 3...4 orë. Pas ekspozimit ndaj acidit ose alkalit, qelizat e bacilit të tuberkulozit mbeten të gjalla dhe të gjithë mikroorganizmat e tjerë që gjenden në materialin e provës vdesin. Pas neutralizimit të acidit ose alkalit, materiali i trajtuar mbillet në një mjedis të ngurtë dhe fitohen koloni të izoluara të patogjenit të tuberkulozit.

4. Metodat diferenciale të diagnostikimit për ngjyrosjen e mikrobeve. Ngjyrosja gram, mekanizmi dhe teknika e ngjyrosjes.

5. Morfologjia e baktereve. Dallimet midis prokariotëve dhe eukariotëve. Format bazë të baktereve.

6. Struktura dhe funksionet e formacioneve sipërfaqësore të një qelize bakteriale. Kapsulë. Metodat e zbulimit.

7. Struktura dhe funksionet e murit qelizor të baktereve gram-pozitive dhe gram-negative. Format e baktereve me defekte të murit qelizor.

8. Strukturat citopazmatike të baktereve, funksionet, metodat e zbulimit. Mikrobet acid-të shpejta. Metoda e ngjyrosjes.

9. Format pushuese të mikrobeve. Sporulimi në baktere, faza, metoda për identifikimin e sporeve.

10. Lëvizshmëria e baktereve, metoda për zbulimin e lëvizshmërisë.

11. Parimet e taksonomisë mikrobiale. Pozicioni sistematik i mikrobeve. Kategoritë taksonomike. Koncepti dhe kriteret e llojit.

12-16. Pozicioni sistematik dhe morfologjia e spiroketeve, aktinomiceteve, mikoplazmave, rikecisë, klamidias. Metodat e studimit.

18. Aparatet respiratore të baktereve. Rrugët e oksidimit biologjik. Klasifikimi i mikrobeve sipas këtij kriteri

19 Metodat e riprodhimit mikrobial. Mekanizmi dhe fazat e ndarjes së qelizave.

20. Karakteristikat e metodës së kërkimit bakteriologjik

21. Mjete ushqyese për aerobet dhe anaerobet. Kërkesat për mjediset ushqyese, klasifikimi.

22. Metodat për izolimin e kulturave të pastra të aerobeve.

23. Metodat për izolimin e kulturave të pastra të anaerobeve.

24. Identifikimi i mikroorganizmave morfologjik, kulturor serologjik, biologjik, gjenetik.

26. Aparati gjenetik i baktereve (kromozomet, plazmidet) karakteristikat e transpozoneve bakteriale. Roli biologjik i plazmideve.

27. Llojet e ndryshueshmërisë së baktereve. Ndryshueshmëria fenotipike dhe gjenotipike. Koncepti i ndryshueshmërisë së popullsisë.

28. Ndryshueshmëria mutacionale. Rikombinimet gjenetike. Rëndësia praktike e ndryshueshmërisë së mikroorganizmave. Koncepti i inxhinierisë gjenetike dhe bioteknologjisë.

29. Diagnostikimi molekular. Synimi. Detyrat. Metodat.

30. Hibridizimi molekular. Reaksioni zinxhir i polimerazës.

31. Doktrina e infeksionit. Kushtet për shfaqjen e një procesi infektiv. Shenjat dalluese të sëmundjeve infektive. Llojet e infeksioneve.

32. Roli i mikroorganizmave në procesin infektiv. Patogjeniteti dhe virulenca Faktorët e patogjenitetit.

33. Roli i makroorganizmit, mjedisit fizik dhe social në procesin infektiv.

34. Metoda biologjike e hulumtimit të problemit, fazat e vlerësimit.

35. Kimioterapia dhe kemoprofilaksia. Klasifikimi i përkufizimit të antibiotikëve.

36. Mekanizmi i veprimit të antibiotikëve.

37. Efektet anësore të antibiotikëve.

38. Rezistenca e mikroorganizmave ndaj antibiotikëve.

39 Metodat për studimin e ndjeshmërisë së mikrobeve ndaj antibiotikëve.

40. Ekologjia e mikroorganizmave. Llojet e lidhjeve mjedisore.

41. Karakteristikat e mikroflorës normale të njeriut dhe roli i saj biologjik. Metodat e studimit. Gnotobiologjia. Disbakterioza. Shkaqet e zhvillimit, parimet e korrigjimit.

42 Sterilizimi, dezinfektimi. Përkufizimi i koncepteve, metodat e zbatimit.

43. Asepsi, antiseptikë. Përkufizimi i koncepteve. Metodat e kryerjes.

22. Metodat për izolimin e kulturave të pastra të aerobeve.

Procesi i izolimit të një kulture të pastër mund të ndahet në disa faza.

Faza e parë. Nga materiali që ekzaminohet përgatitet një njollë, ngjyroset me Gram ose metodë tjetër dhe kopjohet mikroskopikisht. Për inokulim, materiali i provës, nëse është e nevojshme, hollohet në një epruvetë me një zgjidhje sterile izotonike të klorurit të natriumit. Një pikë e hollimit të përgatitur aplikohet në një lak mbi sipërfaqen e agarit ushqyes në një enë Petri dhe fërkohet tërësisht në mjedis me një shpatull, duke e shpërndarë në mënyrë të barabartë materialin në të gjithë sipërfaqen e tij. Pas mbjelljes, kupa kthehet përmbys, etiketohet dhe vendoset në një termostat në temperaturën 37 °C për 18-24 orë.

Faza e dytë. Ata shikojnë nëpër enët dhe studiojnë kolonitë e izoluara, duke i kushtuar vëmendje formës, madhësisë, konsistencës dhe karakteristikave të tjera. Për të përcaktuar morfologjinë e qelizave dhe vetitë e tyre tinktoriale, përgatitet një njollë nga një pjesë e kolonisë në studim, e ngjyrosur me Gram dhe e mikroskopuar. Për të izoluar dhe grumbulluar një kulturë të pastër, një koloni e izoluar ose disa koloni të ndryshme të izoluara nënkulturohen në tuba të veçantë me agar të pjerrët ose me ndonjë mjedis tjetër ushqyes. Për ta bërë këtë, një pjesë e kolonisë hiqet me një lak, pa prekur kolonitë fqinje.

Faza e tretë: Vihet re modeli i rritjes së kulturës së pastër të izoluar. Një kulturë vizualisht e pastër karakterizohet nga një rritje uniforme. Ekzaminimi mikroskopik i njollosjes së njollosur të përgatitur nga një kulturë e tillë zbulon qeliza homogjene morfologjikisht dhe tinktorialisht. Megjithatë, në rastin e polimorfizmit të theksuar të natyrshëm në disa lloje bakteresh, në strishat nga një kulturë e pastër, së bashku me ato tipike, gjenden edhe forma të tjera qelizore.

23. Metodat për izolimin e kulturave të pastra të anaerobeve.

Mjetet ushqyese për anaerobet duhet të plotësojnë kërkesat themelore të mëposhtme: 1) të plotësojnë nevojat ushqyese; 2) të sigurojë rritjen e shpejtë të mikroorganizmave; 3) të reduktohet në mënyrë adekuate

Inokulimet me qëllim të izolimit të mikroflorës anaerobe, si sporeformuese (klostridia) dhe josporore (veillonella, bakteroidet, peptokokët), kryhen në kushte rreptësisht anaerobe. Inokulimet primare bëhen në mjedise pasuruese (tioglycolate, Kitta - Tarozzi), më pas nënkulturohen në mjedise të ngurta: agar me sheqer gjaku në enët Petri, në një kolonë të lartë të agarit me lëndë ushqyese sheqeri ose mjedise të tjera për të marrë koloni të izoluara. Pas inkubimit të të korrave në kushte anaerobe, përgatiten njolla nga kolonitë bakteriale që rezultojnë, ngjyrosen, mikroskopohen dhe më pas nënkulturohen në mjedisin Kitt-Tarozzi dhe në mjedise agar për të izoluar një kulturë të pastër.

Kur izolohen bakteret anaerobe që formojnë spore (klostridia), inokulimet fillestare nxehen në një banjë uji në një temperaturë prej 80 °C për 20 minuta për të shkatërruar qelizat vegjetative të mikroflorës së huaj që mund të jenë të pranishme në materialin e provës.

24. Identifikimi i mikroorganizmave morfologjik, kulturor serologjik, biologjik, gjenetik.

Identifikimi është përcaktimi i një pozicioni sistematik, ndarja nga çdo burim në nivelin e një specie ose varianti.

25. Metoda e identifikimit biokimik: përcaktimi i proteolitit. vetitë sakarolitike, lipolitike, identifikimi i hemolizinave dhe oksidoreduktazave. Përdorimi i analizuesve mikrobiologjikë automatikë .

Kjo metodë përfshin studimin e degradimit enzimatik të substrateve të ndryshme (karbohidratet, aminoacidet dhe proteinat, ure, peroksid hidrogjeni, etj.) me formimin e ndërmjetëm dhe përfundimtar.

produkteve.

Karbohidrazat- enzimat që zbërthejnë karbohidratet. Me përcaktimin e karbohidratave, të ashtuquajturat vetitë sakarolitike të mikrobeve. Për këtë qëllim, përdoren mediat e mëposhtme:

a) Hiss media (të lëngshme dhe gjysmë të lëngshme me tregues). Si ky i fundit përdoret reagenti i Andredes, bromothymol blu ose BP.Aktiviteti enzimatik i baktereve gjykohet nga ndryshimi i ngjyrës së mediumit dhe formimi i gazit;

b) mjete diagnostikuese diferenciale me laktozë (Endo, Levina, Ploskireva, etj.);

c) media polikarbohidrate (si Olkenitsky, Kligler, etj.).

Proteazat-enzimat që zbërthejnë proteinat:

a) kultura në studim mund të zbërthejë proteinat e substratit me formimin e peptonit, albuminës dhe aminoacideve. Ky proces ndodh për shkak të enzimave proteinaza dhe peptidaza. Për të identifikuar këto enzima, kultura në studim inokulohet në një sërë mediumesh: hirrë e mpiksur, një kolonë xhelatine (lëngëzimi në raste pozitive), agar qumështi në një enë Petri (në raste pozitive, zona turbullimi shfaqen rreth kolonive) ;

b) zbërthimi i aminoacideve nga mikrobet mund të ndodhë nëpërmjet dekarboksilimit ose deaminimit. Në rastin e parë, aminet formohen nga një aminoacid ose një tjetër, të cilat zbulohen ose me elektroforezë. ose duke alkalizuar mjedisin. Prania e deaminazave në një mikrob gjykohet nga formimi i amoniakut në mjedis si rezultat i procesit të deaminimit të aminoacideve;

c) zbërthimi i aminoacidit triptafan për shkak të veprimit të enzimës triptafanazë shoqërohet me formimin e indolit. Kjo e fundit zbulohet duke përdorur një copë letre të lagur me acid oksalik dhe të fiksuar nën një tapë mbi mediumin ushqyes. Në raste pozitive, copa e letrës bëhet e kuqe;

d) për të identifikuar enzimat për zbërthimin e aminoacideve që përmbajnë squfur (cistinë, cisteinë), kryhen teste për H2S, si produkt i zbërthimit të këtyre aminoacideve nga desulfurazat. Prania e H2S zbulohet gjithashtu në mjedisin e Olkenitsky;

e) për të identifikuar ureazën, një enzimë që zbërthen urenë, ure dhe një tregues i shtohen mjedisit ushqyes në pH neutral. Në raste pozitive, mediumi ndryshon ngjyrën për shkak të një zhvendosjeje të pH në anën alkaline për shkak të formimit të amoniakut. Lipazat- enzimat për zbërthimin e lipideve dhe lipoideve. Më shpesh, lecithinaza përcaktohet duke vendosur në agar të verdhë veze. Lecitinaza e zbërthen lecitinën në fosfokolinë dhe digliceride. Në këto raste, me rritjen e kolonive, rreth tyre shfaqen zona opaleshente, duke reflektuar aktivitetin e lecitinazës.

Enzimat toksike : Hemolizinat janë enzima që shpërbëjnë membranën fosfolipide të eritrociteve. Ato zbulohen duke inokuluar kulturën në agar të gjakut (5-10%). Ka b-hemolizë ose hemolizë të plotë, kur rreth kolonive formohen zona pastrimi, a-hemolizë, hemolizë jo të plotë, kur rreth kolonive ka zona të gjelbra. Mungesa e hemolizës quhet d-hemolizë.

Citotoksina- enzimat që kanë një efekt toksik në qelizat e synuara. Për shembull, citotoksiciteti i toksinës së mikroorganizmave anaerobe përcaktohet në kulturën e qelizave. Për këtë qëllim, 1 g material (feçe ose të tjera) hollohet në tampon fosfati 1:10 masë/vëllim, centrifugohet për 30 min në 4000 rpm. Supernatanti filtrohet në një filtër 2O nm, shtohet në një shtresë të vetme të kulturës së qelizave McCoy dhe inkubohet në 37°C për 24-48 orë derisa të arrihet një efekt toksik.

Përcaktimi imunokimik i prodhimit të toksinave: si rregull, një metodë imunosorbente e lidhur me enzimën përdoret për të përcaktuar shumë ekzotoksina - difteria, kolera, stafilokoku etj. Për këtë qëllim përdoren sistemet e testimit bazuar në antitrupat monoklonale ndaj një ekzotoksine specifike.

Pasmokoagulaza- një enzimë që koagulon plazmën e gjakut të kafshëve. Përcaktuar në një reaksion provëz. Në 1 ml plazma citrat lepuri ose njeriu (e plotë ose e holluar 2 dhe 4 herë me kripë), përzihet një lak i një kulture agar ditore të mikrobit. Përzierja inkubohet në një termostat në 37°C. Në raste pozitive, pas 2-4 orësh plazma mpikset (shfaqet një mpiksje). Lecithinase - shih më lart.

Reduktazat e oksidit:

1. Përkufizimi oksidazat. Shiritat e kulturës së testimit aplikohen në një lak mbi letër filtri të lagur me një tretësirë ​​1% të tetrametilparafenilendiaminës. Në një rast pozitiv, shfaqet ngjyrosja vjollcë e vijave (brenda 1 min).

2. Përcaktimi i katalazës. Një pikë prej 3% zgjidhje të peroksidit të hidrogjenit aplikohet në një rrëshqitje qelqi dhe një lak i kulturës së provës futet atje. Në prani të katalazës, formohen flluska oksigjeni.

3. Përcaktimi i dehidrazave. Prania e dehidrazave gjykohet nga aftësia reduktuese e mikrobit, d.m.th. aftësia për të reduktuar disa ngjyra organike (për shembull, 1% zgjidhje ujore e blu metilenit). Një bojë (pranues hidrogjeni) shtohet në një kolonë me agar sheqeri (dhurues hidrogjeni) dhe kultura mikrobike inokulohet me një injeksion. Në raste pozitive, mikrobi që rritet në një medium të tillë e zbardh atë.

4. Përcaktimi i spektrit të acideve yndyrore me zinxhir të shkurtër (SCFA), Mikroorganizmat anaerobe prodhojnë produkte të ndërmjetme, duke përfshirë acidet yndyrore me zinxhir të shkurtër dhe alkoolet, spektri (profili) i të cilave është i ndryshëm në lloje të ndryshme të mikroorganizmave dhe lejon identifikimin e mikroorganizmave në nivelin e gjinisë. Më të testuarit janë acidet acetik, propionik, butil, izobutil, valerik, izovalerik, kaproik dhe izokaproik. Për të përcaktuar SCFA-të, përdoret metoda e kromatografisë gaz-lëng. Mikroorganizmat si aktinomicetet, prolionibakteret, eubakteret, bifidobakteret dhe klostridia janë identifikuar.

Vitet e fundit, laboratorët bakteriologjikë kanë përdorur sisteme testimi komerciale për identifikimin e shpejtë biokimik (përcaktimi i aktivitetit biokimik të grupeve të ndryshme të mikroorganizmave): për shembull, testet 2O për enterobakteret dhe testet ZO për anaerobet. Skema e identifikimit përfshin hapat e mëposhtëm:

Kolonitë ---- Përgatitja ---- Aplikimi ----- Inkubimi ---- Kontabiliteti (+ -) ---- Ndër-

pezullime pezullime 4 orë 37°C prezantim të mërkurën

Si material identifikues, përdoret një koloni e izoluar mirë në një pjatë ose një kulturë e pastër në një epruvetë, nga e cila përgatitet një suspension në përqendrimin e standardit të densitetit optik N4, më pas në puse shtohet 55 μl suspension. me mediat e këtij sistemi testimi. Pllaka me shirita inkubohet në 37°C për 4 orë. Kontabiliteti mund të kryhet automatikisht (duke përdorur pajisjen ATV) ose vizualisht.Rezultati i një reaksioni biokimik vlerësohet në formën "+" ose "-" dhe futet një tabelë referimi në të cilën një rezultat pozitiv korrespondon me një shprehje numerike. , duke rezultuar në një profil të caktuar numerik që korrespondon me një indeks të profilit analitik të zhvilluar posaçërisht që ju lejon të identifikoni shpejt një ose një tjetër

mikroorganizëm.

77288 0

Vetitë kulturore të baktereve

Vetitë kulturore (ose makromorfologjike) përfshijnë tipare karakteristike të rritjes së mikroorganizmave në mjedise ushqyese të ngurta dhe të lëngshme. Në sipërfaqen e mjediseve të dendura ushqyese, në varësi të farës, mikroorganizmat mund të rriten në formën e kolonive, vijave ose një lëndinë të vazhdueshme.

Një koloni është një koleksion i izoluar i qelizave të të njëjtit lloj që u rrit nga një qelizë (klon qelizash). Në varësi të vendit ku rritet mikroorganizmi (në sipërfaqen e një mjedisi të dendur ushqyes ose në trashësinë e tij), dallohen kolonitë sipërfaqësore, të thella dhe të poshtme.

Kolonitë e rritura në sipërfaqen e mjedisit janë të ndryshme: ato janë specifike për speciet dhe studimi i tyre përdoret për të përcaktuar speciet e kulturës në studim.

Kur përshkruhen kolonitë, merren parasysh karakteristikat e mëposhtme:
1) forma e kolonisë - e rrumbullakët, amoeboid, rizoid, i parregullt, etj.;

2) madhësia (diametri) e kolonisë - shumë e vogël (me majë) (0,1-0,5 mm), e vogël (0,5-3 mm), e mesme (3-5 mm) dhe e madhe (më shumë se 5 mm në diametër);

3) sipërfaqja e kolonisë është e lëmuar, e përafërt, e palosur, e rrudhur, me rrathë koncentrikë ose e strijuar në mënyrë radiale;

4) profili i kolonisë - i sheshtë, konveks, në formë koni, në formë krateri, etj.;

5) transparencë - e shurdhër, mat, me shkëlqim, transparent, pluhur;

6) ngjyra e kolonisë (pigmenti) - e pangjyrë ose e pigmentuar (e bardhë, e verdhë, e artë, e kuqe, e zezë), veçanërisht vini re lëshimin e pigmentit në medium me ngjyrosjen e tij;

7) buza e kolonisë - e lëmuar, e valëzuar, e dhëmbëzuar, e skajshme, etj.;

8) struktura e kolonisë - homogjene, me kokërr të imët ose të trashë, me vija; skaji dhe struktura e kolonisë përcaktohen duke përdorur një xham zmadhues ose me zmadhim të ulët të një mikroskopi duke vendosur një enë Petri me inokulimin në tryezën e mikroskopit me kapakun poshtë;

9) qëndrueshmëria e kolonisë; përcaktohet duke prekur sipërfaqen me një lak: kolonia mund të jetë e dendur, e butë, që rritet në agar, mukoze (shtrihet pas lakut), e brishtë (thyehet lehtësisht kur është në kontakt me lak).

Kolonitë e thella më së shpeshti duken si thjerrëza pak a shumë të rrafshuara (formë ovale me skajet e mprehta), nganjëherë gunga leshi pambuku me dalje si fije në mjedisin ushqyes. Formimi i kolonive të thella shoqërohet shpesh me këputje të mediumit të dendur nëse mikroorganizmat lëshojnë gaz.

Kolonitë e poshtme zakonisht duken si filma të hollë transparentë që përhapen përgjatë pjesës së poshtme.

Karakteristikat e kolonisë mund të ndryshojnë me moshën; ato varen nga përbërja e mjedisit dhe temperatura e kultivimit.

Rritja e mikroorganizmave në mjedise të lëngshme ushqyese merret parasysh duke përdorur kultura katër deri në shtatë ditore të rritura në kushte stacionare.

Në mjediset ushqyese të lëngëta, me rritjen e mikroorganizmave, vërehet turbullira e mediumit dhe formimi i një filmi ose sedimenti.

Kur rriten në media ushqyese gjysmë të lëngshme (0,5-0,7% agar), mikrobet e lëvizshme shkaktojnë turbullirë të theksuar, format e palëvizshme rriten vetëm gjatë mbjelljes me injeksion në mjedis.

Shpesh rritja e mikrobeve shoqërohet me shfaqjen e erës, pigmentimin e mjedisit dhe lëshimin e gazit. Era karakteristike e kulturave të disa llojeve të baktereve lidhet me formimin e estereve të ndryshëm (acetat etilik, amil acetat etj.), indolit, merkaptanit, sulfurit të hidrogjenit, skatolit, amoniakut, acidit butirik.

Aftësia për të formuar pigmente është e natyrshme në shumë lloje të mikroorganizmave. Natyra kimike e pigmenteve është e larmishme: karotenoidet, antocianinet, melaninat. Nëse pigmenti është i patretshëm në ujë, njolloset vetëm pllaka kulturore; nëse është i tretshëm, edhe lënda ushqyese bëhet me ngjyrë. Besohet se pigmentet mbrojnë bakteret nga efektet e dëmshme të dritës së diellit, kjo është arsyeja pse ka kaq shumë baktere të pigmentuara në ajër; përveç kësaj, pigmentet janë të përfshirë në metabolizmin e këtyre mikroorganizmave.

Në natyrë, ekzistojnë të ashtuquajturat baktere fosforeshente, kulturat e të cilave shkëlqejnë në errësirë ​​me një dritë të gjelbër-kaltërosh ose të verdhë. Baktere të tilla gjenden kryesisht në ujërat e lumenjve ose detit. Bakteret ndriçuese - fotobakteret - përfshijnë bakteret aerobe (vibrios, koket, shufrat).

Izolimi i kulturave të pastra të mikroorganizmave

Një kulturë e pastër është një kulturë që përmban mikroorganizma të së njëjtës specie. Izolimi i kulturave të pastra të baktereve është një fazë e detyrueshme e hulumtimit bakteriologjik në praktikën laboratorike, në studimin e ndotjes mikrobike të objekteve të ndryshme mjedisore dhe në përgjithësi në çdo punë me mikroorganizma.

Materiali në studim (uji, toka, ajri, ushqimi ose objekte të tjera) zakonisht përmban shoqata mikrobesh.

Izolimi i një kulture të pastër bën të mundur studimin e karakteristikave morfologjike, kulturore, biokimike, antigjenike dhe të tjera, tërësia e të cilave përcakton llojin dhe llojin e patogjenit, d.m.th., bëhet identifikimi i tij.

Për të izoluar kulturat e pastra të mikroorganizmave, përdoren metoda që mund të ndahen në disa grupe:
1. Metoda e Pasteur - hollimi sekuencial i materialit të provës në një mjedis të lëngshëm ushqyes në përqendrimin e një qelize në vëllim (ka rëndësi historike).

2. Metoda Koch (“instalimi i pllakës”) - hollimi sekuencial i materialit testues në agar të shkrirë (temperatura 48-50 C), e ndjekur nga derdhja në enët Petri, ku agari ngurtësohet. Inokulimet bëhen, si rregull, nga tre-katër hollimet e fundit, ku bakteret pakësohen dhe më vonë, teksa rriten në enët Petri, shfaqen koloni të izoluara, të formuara nga një qelizë mëmë fillestare. Nga kolonitë e izoluara thellë në agar, një kulturë e pastër bakteresh merret nga nënkultura në mjedise të freskëta.

3. Metoda Shukevich - përdoret për të marrë një kulturë të pastër të Proteus dhe mikroorganizmave të tjerë me rritje "zvarritëse". Materiali i provës inokulohet në ujin e kondensimit në bazën e pjerrësisë së agarit. Mikrobet e lëvizshme (Proteus) janë në gjendje të ngrihen lart në agarin e pjerrët, format e palëvizshme mbeten të rriten poshtë, në vendin e mbjelljes. Duke rimbjellur skajet e sipërme të kulturës, mund të merrni një kulturë të pastër.

4. Metoda Drigalsky - përdoret gjerësisht në praktikën bakteriologjike, në të cilën materiali që studiohet hollohet në një epruvetë me tretësirë ​​të kripur sterile ose supë. Një pikë e materialit shtohet në filxhanin e parë dhe shpërndahet mbi sipërfaqen e mediumit me një shpatull qelqi steril. Më pas me të njëjtën shpatull (pa djegur në flakën e djegies) bëhet e njëjta mbjellje në filxhanin e dytë dhe të tretë.

Me çdo inokulim të baktereve, gjithnjë e më pak mbetet në shpatull dhe, kur mbillet në filxhanin e tretë, bakteret do të shpërndahen mbi sipërfaqen e mediumit ushqyes veçmas nga njëri-tjetri. Pas 1-7 ditësh nga mbajtja e enëve në një termostat (në varësi të shkallës së rritjes së mikroorganizmave), në pjatën e tretë, çdo bakter prodhon një klon qelizash, duke formuar një koloni të izoluar, e cila nënkulturohet në agar të pjerrët në mënyrë që të grumbullohet. një kulturë e pastër.

5. Metoda Weinberg. Vështirësi të veçanta lindin kur izolohen kulturat e pastra të anaerobeve të detyrueshme. Nëse kontakti me oksigjenin molekular nuk shkakton menjëherë vdekjen e qelizave, atëherë mbjellja kryhet sipas metodës Drigalsky, por pas kësaj enët vendosen menjëherë në një anaerostat. Sidoqoftë, metoda e mbarështimit përdoret më shpesh. Thelbi i tij qëndron në faktin se hollimi i materialit në studim kryhet në një mjedis ushqyes agar të shkrirë dhe të ftohur në 45-50 oC.

Bëhen 6-10 hollime të njëpasnjëshme, më pas mediumi në provëza ftohet shpejt dhe sipërfaqja mbulohet me një shtresë të përzierjes së parafinës dhe vazelinës për të parandaluar depërtimin e ajrit në trashësinë e mediumit ushqyes. Ndonjëherë lënda ushqyese, pas mbjelljes dhe përzierjes, transferohet në tuba Burri steril ose në pipeta kapilare Pasteur, skajet e të cilave mbyllen. Me hollimin e suksesshëm, kolonitë e izoluara të anaerobeve rriten në epruveta, tuba Burri dhe pipeta Pasteur. Për të siguruar që kolonitë e izoluara të jenë qartësisht të dukshme, përdoren mjete ushqyese të pastruara.

Për nxjerrjen e kolonive të izoluara të anaerobeve, tubi nxehet pak duke e rrotulluar mbi një flakë, ndërsa agari ngjitur me muret shkrihet dhe përmbajtja e tubit në formën e një kolone agari rrëshqet në një enë Petri sterile. Kolona e agarit pritet me piskatore sterile dhe kolonitë hiqen me një lak. Kolonitë e nxjerra vendosen në një mjedis të lëngshëm të favorshëm për zhvillimin e mikroorganizmave të izoluar. Mediumi i agarit fryhet nga tubi Burri duke e kaluar gazin përmes një tape pambuku.

6. Metoda Hungate. Kur duan të marrin koloni të izoluara bakteresh me ndjeshmëri veçanërisht të lartë ndaj oksigjenit (aerobet strikte), përdoret metoda e tubit rrotullues Hungate. Për ta bërë këtë, mediumi i shkrirë i agarit inokulohet me baktere me një rrymë konstante përmes një epruveti me gaz inert të çliruar nga papastërtitë e oksigjenit. Tubi më pas mbyllet me një tapë gome dhe vendoset horizontalisht në një kapëse që rrotullon tubin; mediumi shpërndahet në mënyrë të barabartë mbi muret e epruvetës dhe ngurtësohet në një shtresë të hollë. Përdorimi i një shtrese të hollë në një epruvetë të mbushur me një përzierje gazi lejon që dikush të marrë koloni të izoluara që janë qartë të dukshme me sy të lirë.

7. Izolimi i qelizave individuale duke përdorur një mikromanipulator. Një mikromanipulator është një pajisje që ju lejon të hiqni një qelizë nga një pezullim duke përdorur një mikropipetë ose mikroloop të veçantë. Ky operacion kontrollohet nën një mikroskop. Në skenën e mikroskopit është instaluar një dhomë me lagështi, në të cilën vendoset preparati i varur i pikave. Mikropipetat (mikropopat) janë të fiksuara në mbajtëset e stendave operative, lëvizja e të cilave në fushën e shikimit të mikroskopit kryhet me saktësi mikron falë një sistemi vidash dhe levash. Studiuesi, duke parë përmes një mikroskopi, heq qelizat individuale me mikropipeta dhe i transferon ato në tuba që përmbajnë një mjedis të lëngshëm steril për të marrë një klon qelizor.

L.V. Timoschenko, M.V. Çubik

Nëse, në bazë të simptomave të caktuara në bimë dhe rezultateve të ekzaminimit mikroskopik, dyshohet se shkaktari i sëmundjes është një bakter, hapi tjetër duhet të jetë izolimi i tij.

Në këtë rast, supozohet se patogjeni është i kontaminuar me organizma shoqërues, d.m.th., ka një popullsi të përzier. Për të marrë patogjenin në formën e një kolonie të veçantë në rritje, macerati i indeve duhet të vendoset në medium.

Mbjellja me një prekje. Duke përdorur një lak të kalcinuar të vaksinimit, merrni një sasi të vogël macerati të indeve bimore që përmban baktere dhe, me lëvizje të lehta, pa dëmtuar sipërfaqen e agarit, aplikoni 4-6 goditje në mediumin ushqyes të përgatitur. Pas kalcinimit të lakut, filxhani me medium kthehet 90° djathtas dhe më pas bëhen 4-6 goditje të tjera nga goditja e dytë, gjilpëra kalcinohet përsëri dhe kryhet mbjellja e tretë. Kështu arrihet një hollim i lëndës fillestare në mënyrë që bakteret, pas inkubimit në një termostat për 48-72 orë në 28 °C, të formojnë koloni individuale të formave dhe ngjyrave të ndryshme. Kolonitë më pas transferohen në tubat e pjerrët të agarit për ekzaminim të mëtejshëm. Duke përdorur një lak të kalcinuar, merrni një koloni dhe aplikojeni atë në agar ushqyes me një lëvizje të kujdesshme në formën e një gjarpri ose zigzag.

Metoda e derdhjes Koch. Metoda e pllakës Koch siguron që çdo koloni të formohet nga një qelizë e vetme bakteriale. Është mirë që të përgatisni një suspension nga materiali fillestar në ujë steril dhe të përdorni metodën Koch vetëm me këtë hollim. Një sasi e vogël e suspensionit transferohet në epruvetën e parë me një lëndë ushqyese të ftohur në 60 °C. Pastaj përmbajtja e tubit përzihet me inokulumin duke e rrotulluar atë midis pëllëmbëve. Më pas, merrni një epruvetë të dytë, hapeni me kujdes mbi flakën e djegësit dhe përdorni sythe të mëdha për të transferuar tre pjesë të substratit në të nga provëza e parë. Pas shkrepjes së qafës dhe tapës, përmbajtja e epruvetës hidhet në enën e parë Petri, duke hapur kapakun e enës aq sa të futet qafa e epruvetës nën të. Menjëherë pas derdhjes mbylleni filxhanin dhe shpërndajeni me kujdes lëndën ushqyese në mënyrë të barabartë.

Pasi të keni përzier plotësisht përmbajtjen e epruvetës së dytë, merrni një provëz të tretë dhe transferoni gjashtë pjesë të substratit nga e dyta në të me një lak. Përmbajtja e epruvetës hidhet në një filxhan dhe përmbajtja e epruvetës, pas përzierjes, hidhet në filxhan. Enët me medium inkubohen në një termostat në 28°C; pas disa ditësh, bakteret e përfshira në lëndën fillestare formojnë koloni.

Mbarështimi serik. Nëse, për shembull, është e nevojshme të izolohen bakteret nga toka, atëherë përdoret hollimi serik. Mjeti ushqyes steril (15 ml për filxhan) derdhet në gota, 0,1 ml nga tre hollimet e fundit të suspensionit aplikohet në agarin e ngurtësuar dhe shpërndahet mbi sipërfaqe me një shpatull xhami.

Për të izoluar bakteret, 1 g tokë pezullohet në 9 ml ujë, tundet mirë, lihet të qetësohet për disa sekonda dhe nga suspensioni përgatiten hollime serike. Duke përdorur këtë metodë, mund të përcaktohet numri i mikroorganizmave në çdo mostër.

Nëse gjeni një gabim, ju lutemi theksoni një pjesë të tekstit dhe klikoni Ctrl+Enter.

Në një seri hollimesh të njëpasnjëshme dhjetëfish të mostrës së provës nga 2 hollimet e fundit (shkalla e hollimit varet nga numri i CFU në 1 dozë të barit të testuar), 0,1 ml suspension mikrobik mbillet në enët Petri me një lëndë ushqyese. mesatare (2 gota për çdo hollim). Pezullimi shpërndahet në mënyrë të barabartë mbi sipërfaqen e mediumit duke përdorur një shpatull Drigalski ose rruaza qelqi derisa suspensioni të përthithet plotësisht (të thahet). Enët mbulohen dhe vendosen me kokë poshtë në një furrë inkubacioni.

Të lashtat inkubohen në një temperaturë prej (37  1) o C për 24–96 orë në kushte adekuate, në varësi të llojit të mikroorganizmit (aerobik, mikroaerofil ose anaerobik). Kur inkubohen në kushte anaerobe ose mikroaerofilike, enët Petri me kultura vendosen në një anaerostat dhe krijohet atmosfera e nevojshme e gazit.

Kjo metodë mund të përdoret për të përcaktuar numrin e baktereve të gjalla të secilës specie në probiotikët shumëkomponentë, me kusht që bakteret e përfshira në preparat të formojnë koloni që dallohen vizualisht nga forma dhe karakteristikat e tjera.

1.2. Metoda e filxhanit të thellë

Në një seri hollimesh të njëpasnjëshme dhjetëfish të mostrës së provës nga 2 hollimet e fundit (shkalla e hollimit varet nga numri i CFU në përgatitjen e provës), 1,0 ml suspension mikrobik shtohet në enët Petri me diametër 90 mm duke përdorur një pipetë sterile me një kapacitet 1,0 ml (2 gota për çdo hollim). Shtoni 20–25 ml lëndë ushqyese të shkrirë dhe të ftohur në një temperaturë prej 42,5 ± 2,5 o C, mbylleni dhe përzieni shpejt me kujdes me lëvizje rrotulluese dhe përkthimore, pa e hequr pjesën e poshtme të filxhanit nga sipërfaqja e tavolinës dhe duke parandaluar që mediumi të marrë. në kapakun e filxhanit. Pasi agari të jetë ngurtësuar, enët Petri kthehen përmbys dhe inkubohen në kushte të përshtatshme në një temperaturë prej (37  1) o C për kohën e nevojshme për mikroorganizmin e caktuar.

Kontabiliteti për rezultatet

Në fund të inkubacionit, numërohen kolonitë e rritura në enët Petri dhe llogaritet përmbajtja e baktereve të gjalla në 1 dozë të kampionit të provës. Gjatë numërimit, u morën parasysh pllaka në të cilat u rritën të paktën 15 koloni.

Shembull i llogaritjes Përmbajtja e qelizave mikrobike të gjalla në 1 dozë të mostrës së testuar:

– nga një hollim prej 10 -7, 42 dhe 45 koloni u rritën; mesatarja aritmetike është (42+45): 2 = 43,5;

– nga një hollim prej 10 -6, u rritën 410 dhe 450 koloni; mesatarja aritmetike është (410+450) : 2 = 430;

– numri i baktereve të gjalla në 1 dozë është i barabartë me:

(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .

Shumëzoni mesataren aritmetike të numrit të kolonive me shkallën e hollimit dhe, nëse mbjellja në një enë Petri bëhet në një vëllim prej 0,1 ml, shumëzoni me një faktor 10 për ta kthyer në 1,0 ml.

Metoda e kufizimit të hollimeve e ndjekur nga mbjellja në mjedise ushqyese të lëngëta dhe gjysmë të lëngshme

Metoda e epruvetës së numrave më të mundshëm (përcaktimi i numrit të acidophilus lactobacilli të gjallë)

Në një seri hollimesh të njëpasnjëshme dhjetëfish të mostrës së provës 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 (shkalla e hollimit varet nga numri i CFU në kampionin e provës), 1 ml suspension mikrobial nga secili hollimi inokulohet në 2 epruveta me 9 ml qumësht steril pa yndyrë. Vihet re se nga cili hollim është bërë kultura. Një hollim prej 10 -6 të barit në një zgjidhje 0.9% klorur natriumi korrespondon me një hollim prej 10 -6 në qumësht. Për të kontrolluar mjedisin, shtoni 4 epruveta të painokuluara me qumësht. Tubat e inokuluara dhe ato të kontrollit inkubohen në një temperaturë prej (38  1) 0 C për 3-4 ditë.

Në fund të inkubacionit, përcaktohet numri i provëzave me qumësht të gjizë. Nga mpiksja e kulturës përgatiten njolla dhe ngjyrosen me Gram. Nëse bakteret karakteristike janë të dukshme në njolla dhe nuk ka mikroflorë të huaj, atëherë ky hollim merret parasysh se përmban mikroorganizma të këtij lloji. Në rastin e fermentimit të qumështit në tubat e kontrollit dhe nëse mikroflora e huaj zbulohet në njolla, kontrolli kryhet në një grup të ri mediumi.

Kontabiliteti për rezultatet

Kur llogaritni numrin e individëve të gjallë, përdorni tabelën McCready (Tabela 1). Së pari, përpilohet një karakteristikë numerike. Ai përbëhet nga 3 numra: në radhë të parë (në të majtë) vendosni një numër të barabartë me numrin e epruvetave me qumësht të gjizë të marrë në hollimin e fundit ku qumështi është gjizë në të gjitha epruvetat (për shembull, 2 epruveta të hollimi 10 -6).

Dy numrat e mëposhtëm tregojnë numrin e epruvetëve me qumësht të thartuar në 2 hollime të mëpasshme (për shembull, në 1 epruvetë me hollim 10 -7 dhe në 1 epruvetë me hollim 10 -8).

Karakteristika numerike e rezultatit do të jetë 211.

Duke përdorur tabelën McCready, gjeni numrin e mundshëm që korrespondon me karakteristikën dixhitale të marrë (në rastin tonë, 13), shumëzojeni atë me hollimin, i cili korrespondon me shifrën e parë të karakteristikës numerike (në këtë shembull, 10 -6). Atëherë numri i mikroorganizmave të gjallë në 1 dozë është 13 ∙ 10 6 = 1.3 ∙ 10 7.

Tabela 1 - Tabela McCready e përdorur gjatë llogaritjes së numrit të acidophilus lactobacilli të gjallë

Karakteristikë numerike	Numri më i mundshëm i mikroorganizmave kur inokulohet në 2 tuba paralelë