Metode Pasteur (metode pengenceran pembatas). Ini terdiri dari pembuatan serangkaian pengenceran berturut-turut dari bahan yang diteliti dalam media nutrisi cair. Untuk melakukan ini, setetes inokulum dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan media cair steril, setetes inokulum dipindahkan ke tabung reaksi berikutnya dan hingga 8...10 tabung reaksi diinokulasi dengan cara ini. Dengan setiap pengenceran, jumlah sel mikroba yang masuk ke dalam medium akan berkurang dan dimungkinkan untuk memperoleh pengenceran dimana di seluruh tabung reaksi dengan medium hanya akan ada satu sel mikroba, yang darinya akan diperoleh kultur murni mikroorganisme. mengembangkan. Karena mikroba tumbuh secara difus dalam media cair, mis. mudah didistribusikan ke seluruh lingkungan, sulit untuk mengisolasi satu sel mikroba dari sel mikroba lainnya. Dengan demikian, metode Pasteur tidak selalu menghasilkan kultur murni. Oleh karena itu, saat ini, metode ini digunakan terutama untuk mengurangi konsentrasi mikroorganisme dalam bahan sebelum menginokulasikannya ke dalam media padat untuk mendapatkan koloni terisolasi.

Metode pemisahan mikroorganisme secara mekanis menggunakan media nutrisi padat. Metode tersebut antara lain metode Koch dan metode Drigalski.

Metode Koch (metode penaburan dalam). Bahan uji dimasukkan dengan loop bakteriologis atau pipet Pasteur ke dalam tabung reaksi dengan media nutrisi padat cair. Aduk isi tabung reaksi secara merata dengan memutarnya di antara kedua telapak tangan. Setetes bahan encer dipindahkan ke tabung reaksi kedua, dari tabung kedua ke tabung ketiga, dan seterusnya. Isi masing-masing tabung reaksi, mulai dari yang pertama, dituangkan ke dalam cawan petri steril. Setelah media dipadatkan dalam cawan, media tersebut ditempatkan dalam termostat untuk budidaya.

Untuk mengisolasi mikroorganisme anaerobik menggunakan metode Koch, perlu dilakukan pembatasan akses oksigen ke kultur. Untuk tujuan ini, permukaan penyemaian dalam cawan Petri diisi dengan campuran steril parafin dan petroleum jelly (1:1). Anda juga dapat membiarkan inokulum, tercampur rata dengan media agar, langsung di dalam tabung reaksi. Dalam hal ini sumbat kapas diganti dengan sumbat karet atau permukaan agar-agar diisi dengan campuran parafin dan petroleum jelly. Untuk mengekstraksi koloni mikroorganisme anaerobik yang tumbuh, tabung dipanaskan sedikit dengan memutar cepat di atas api pembakar. Agar-agar yang berdekatan dengan dinding meleleh, dan kolom dengan mudah dimasukkan ke dalam cawan Petri yang telah disiapkan. Selanjutnya kolom agar dipotong dengan pisau bedah steril, koloni dihilangkan dengan loop steril atau pemotong kapiler steril dan dipindahkan ke media cair.

Metode Drigalski didasarkan pada pemisahan mekanis sel mikroba pada permukaan media nutrisi padat dalam cawan Petri. Setiap sel mikroba, yang menetap di tempat tertentu, mulai berkembang biak, membentuk koloni.

Untuk penyemaian dengan metode Drygalsky, digunakan beberapa cawan Petri yang berisi media nutrisi padat. Setetes bahan uji diteteskan pada permukaan medium. Kemudian dengan menggunakan spatula steril, tetesan tersebut disebarkan ke seluruh media nutrisi (penyemaian rumput).

Penaburan juga dapat dilakukan dengan cara coretan menggunakan loop bakteriologis. Spatula atau lingkaran yang sama digunakan untuk menabur benih kedua, ketiga, dan seterusnya. cangkir. Biasanya, pada cawan pertama setelah budidaya benih, pertumbuhan mikroba muncul dalam bentuk lapisan kontinu; pada cawan berikutnya, kandungan mikroorganisme berkurang dan terbentuk koloni terisolasi, yang darinya kultur murni dapat dengan mudah diisolasi dengan penyaringan. .

Jadi, di sektor pertama, pertumbuhan berkelanjutan diperoleh, dan sepanjang pukulan berikutnya, koloni terisolasi akan tumbuh, mewakili keturunan dari satu sel.

Untuk menghemat media dan peralatan, Anda dapat menggunakan satu cangkir, membaginya menjadi beberapa sektor, dan menaburkannya secara berurutan (metode depleting coretan). Untuk melakukan ini, ambil bahan dalam satu lingkaran dan gambarlah serangkaian goresan paralel dengannya, pertama di sepanjang permukaan sektor pertama, dan kemudian secara berturut-turut menyemai semua sektor lainnya dengan sel-sel yang tersisa pada lingkaran. Dengan setiap pukulan berikutnya, jumlah sel yang diunggulkan berkurang.

Metode isolasi kultur murni dengan menggunakan bahan kimia digunakan untuk mengisolasi kultur mikroorganisme yang resisten terhadap bahan kimia tertentu. Misalnya, dengan menggunakan metode ini, dimungkinkan untuk mengisolasi kultur murni mikobakteri tuberkulosis yang tahan terhadap asam, basa, dan alkohol. Dalam hal ini bahan uji diisi dengan larutan asam 15% atau antiformin sebelum disemai dan disimpan dalam termostat selama 3...4 jam. Setelah terpapar asam atau basa, sel-sel basil tuberkulosis tetap hidup, dan semua mikroorganisme lain yang terkandung dalam bahan uji mati. Setelah asam atau alkali dinetralkan, bahan yang diolah ditaburkan pada media padat dan diperoleh koloni patogen tuberkulosis yang terisolasi.

4. Metode diagnostik diferensial pewarnaan mikroba. Pewarnaan gram, mekanisme dan teknik pewarnaan.

5. Morfologi bakteri. Perbedaan antara prokariota dan eukariota. Bentuk dasar bakteri.

6. Struktur dan fungsi bentukan permukaan sel bakteri. Kapsul. Metode deteksi.

7. Struktur dan fungsi dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif. Bentuk bakteri dengan cacat dinding sel.

8. Struktur sitopasmatik bakteri, fungsi, cara deteksi. Mikroba tahan asam. Metode pewarnaan.

9. Bentuk mikroba yang istirahat. Sporulasi pada bakteri, tahapan, cara mengidentifikasi spora.

10. Motilitas bakteri, metode untuk mendeteksi mobilitas.

11. Prinsip taksonomi mikroba. Posisi mikroba yang sistematis. Kategori taksonomi. Konsep dan kriteria tipe.

12-16. Posisi sistematis dan morfologi spirochetes, actinomycetes, mikoplasma, rickettsia, klamidia. Metode belajar.

18. Alat pernafasan bakteri. Jalur oksidasi biologis. Klasifikasi mikroba menurut kriteria ini

19 Metode reproduksi mikroba. Mekanisme dan fase pembelahan sel.

20. Ciri-ciri metode penelitian bakteriologis

21. Media nutrisi untuk bakteri aerob dan anaerob. Persyaratan media nutrisi, klasifikasi.

22. Metode isolasi kultur murni aerob.

23. Metode isolasi kultur murni anaerob.

24. Identifikasi mikroorganisme secara morfologi, serologi kultural, biologi, genetik.

26. Peralatan genetik bakteri (kromosom, plasmid) karakteristik transposon bakteri. Peran biologis plasmid.

27. Jenis variabilitas bakteri. Variabilitas fenotipik dan genotip. Konsep variabilitas populasi.

28. Variabilitas mutasi. Rekombinasi genetik. Signifikansi praktis dari variabilitas mikroorganisme. Konsep rekayasa genetika dan bioteknologi.

29. Diagnostik molekuler. Target. Tugas. Metode.

30. Hibridisasi molekuler. Reaksi berantai polimerase.

31. Doktrin infeksi. Kondisi terjadinya proses infeksi. Tanda-tanda khas penyakit menular. Jenis infeksi.

32. Peran mikroorganisme dalam proses infeksi. Patogenisitas dan virulensi Faktor patogenisitas.

33. Peran makroorganisme, lingkungan fisik dan sosial dalam proses infeksi.

34. Metode penelitian masalah biologis, tahapan penilaian.

35. Kemoterapi dan kemoprofilaksis. Klasifikasi definisi antibiotik.

36. Mekanisme kerja antibiotik.

37. Efek samping antibiotik.

38. Resistensi mikroorganisme terhadap antibiotik.

39 Metode mempelajari sensitivitas mikroba terhadap antibiotik.

40. Ekologi mikroorganisme. Jenis hubungan lingkungan.

41. Ciri-ciri mikroflora normal manusia dan peran biologisnya. Metode belajar. Gnotobiologi. Disbakteriosis. Penyebab pembangunan, prinsip koreksi.

42 Sterilisasi, desinfeksi. Pengertian konsep, metode pelaksanaan.

43. Asepsis, antiseptik. Definisi konsep. Metode pelaksanaan.

22. Metode isolasi kultur murni aerob.

Proses isolasi suatu kultur murni dapat dibagi menjadi beberapa tahap.

Tahap pertama. Apusan dibuat dari bahan yang diperiksa, diwarnai dengan Gram atau metode lain, dan disalin secara mikroskopis. Untuk inokulasi, bahan uji bila perlu diencerkan dalam tabung reaksi dengan larutan natrium klorida isotonik steril. Satu tetes pengenceran yang telah disiapkan dioleskan secara melingkar ke permukaan agar nutrisi dalam cawan Petri dan digosok secara menyeluruh ke dalam media dengan spatula, mendistribusikan bahan secara merata ke seluruh permukaannya. Setelah disemai, cawan dibalik, diberi label dan ditempatkan dalam termostat pada suhu 37 °C selama 18-24 jam.

Fase kedua. Mereka memeriksa piring dan mempelajari koloni yang terisolasi, memperhatikan bentuk, ukuran, konsistensi dan karakteristik lainnya. Untuk menentukan morfologi sel dan sifat tintorialnya, apusan dibuat dari bagian koloni yang diteliti, diwarnai dengan Gram dan dimikroskop. Untuk mengisolasi dan mengakumulasi kultur murni, satu koloni terisolasi atau beberapa koloni terisolasi berbeda disubkultur ke dalam tabung terpisah dengan agar miring atau media nutrisi lainnya. Untuk melakukan ini, sebagian koloni dihilangkan dengan satu lingkaran, tanpa menyentuh koloni tetangga.

Tahap ketiga: Pola pertumbuhan kultur murni terisolasi dicatat. Budaya yang secara visual murni ditandai dengan pertumbuhan yang seragam. Pemeriksaan mikroskopis dari apusan berwarna yang dibuat dari kultur tersebut menunjukkan sel-sel yang homogen secara morfologi dan tintorial. Namun, dalam kasus polimorfisme nyata yang melekat pada beberapa jenis bakteri, bentuk sel lain juga ditemukan pada apusan dari kultur murni, bersama dengan yang khas.

23. Metode isolasi kultur murni anaerob.

Media nutrisi untuk bakteri anaerob harus memenuhi persyaratan dasar sebagai berikut: 1) memenuhi kebutuhan nutrisi; 2) memastikan pertumbuhan mikroorganisme yang cepat; 3) dikurangi secara memadai

Inokulasi untuk tujuan mengisolasi mikroflora anaerobik, baik pembentuk spora (clostridia) maupun yang tidak membentuk spora (veillonella, bacteroides, peptococci), dilakukan dalam kondisi anaerobik yang ketat. Inokulasi primer dilakukan pada media pengayaan (tioglikolat, Kitta - Tarozzi), kemudian disubkultur pada media padat: agar gula darah dalam cawan petri, pada agar nutrien gula kolom tinggi atau media lain untuk mendapatkan koloni terisolasi. Setelah tanaman diinkubasi dalam kondisi anaerobik, apusan dibuat dari koloni bakteri yang dihasilkan, diwarnai, dimikroskop, dan kemudian disubkultur ke dalam media Kitt-Tarozzi dan media agar untuk mengisolasi kultur murni.

Saat mengisolasi bakteri anaerob pembentuk spora (clostridia), inokulasi awal dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80 °C selama 20 menit untuk menghancurkan sel vegetatif mikroflora asing yang mungkin ada dalam bahan uji.

24. Identifikasi mikroorganisme secara morfologi, serologi kultural, biologi, genetik.

Identifikasi adalah penentuan posisi sistematis, pemisahan dari sumber mana pun hingga tingkat suatu spesies atau varian.

25. Metode identifikasi biokimia: penentuan proteolitik. sakarolitik, sifat lipolitik, identifikasi hemolisin dan oksidoreduktase. Penggunaan penganalisis mikrobiologi otomatis .

Metode ini melibatkan studi degradasi enzimatik berbagai substrat (karbohidrat, asam amino dan protein, urea, hidrogen peroksida, dll.) dengan pembentukan zat antara dan akhir.

produk.

Karbohidrase- enzim yang menguraikan karbohidrat. Dengan menentukan karbohidrat, yang disebut sifat sakarolitik mikroba. Untuk tujuan ini, media berikut digunakan:

a) Media desis (cair dan semi cair dengan indikator). Reagen Andrede, bromothymol blue atau BP digunakan sebagai yang terakhir.Aktivitas enzimatik bakteri dinilai dari perubahan warna medium dan pembentukan gas;

b) media diagnostik diferensial dengan laktosa (Endo, Levina, Ploskireva, dll.);

c) media polikarbohidrat (seperti Olkenitsky, Kligler, dll).

Protease-enzim yang menguraikan protein:

a) kultur yang diteliti dapat memecah protein substrat dengan pembentukan pepton, albumin, dan asam amino. Proses ini terjadi karena adanya enzim proteinase dan peptidase. Untuk mengidentifikasi enzim-enzim ini, kultur yang diteliti diinokulasi pada sejumlah media: whey bekuan, kolom gelatin (pencairan dalam kasus positif), agar susu dalam cawan Petri (dalam kasus positif, zona kekeruhan muncul di sekitar koloni) ;

b) pemecahan asam amino oleh mikroba dapat terjadi melalui dekarboksilasi atau deaminasi. Dalam kasus pertama, amina terbentuk dari satu asam amino atau lainnya, yang dideteksi dengan elektroforesis. atau dengan membuat media menjadi basa. Adanya deaminase dalam suatu mikroba dinilai dari terbentuknya amonia dalam medium sebagai hasil proses deaminasi asam amino;

c) pemecahan asam amino triptafan akibat kerja enzim triptafanase disertai dengan pembentukan indol. Yang terakhir dideteksi menggunakan selembar kertas yang dibasahi dengan asam oksalat dan dipasang di bawah sumbat di atas media nutrisi. Dalam kasus positif, selembar kertas berubah menjadi merah;

d) untuk mengidentifikasi enzim pemecahan asam amino yang mengandung belerang (sistin, sistein), dilakukan pengujian terhadap H2S, sebagai produk pemecahan asam amino tersebut oleh desulfurase. Kehadiran H2S juga terdeteksi di lingkungan Olkenitsky;

e) untuk mengidentifikasi urease, enzim yang memecah urea, urea dan indikator ditambahkan ke media nutrisi pada pH netral. Dalam kasus positif, media berubah warna karena pergeseran pH ke sisi basa akibat pembentukan amonia. Lipase- enzim untuk penguraian lipid dan lipoid. Paling sering, lesitinase ditentukan dengan melapisi agar kuning telur. Lesitinase memecah lesitin menjadi fosfokolin dan digliserida. Dalam kasus ini, seiring pertumbuhan koloni, zona opalescent muncul di sekitarnya, mencerminkan aktivitas lesitinase.

Enzim racun : Hemolisin adalah enzim yang memecah membran fosfolipid eritrosit. Mereka dideteksi dengan menginokulasi kultur pada agar darah (5-10%). Ada b-hemolisis atau hemolisis lengkap, bila terbentuk zona bening di sekitar koloni, a-hemolisis, hemolisis tidak lengkap, bila terdapat zona hijau di sekitar koloni. Tidak adanya hemolisis disebut sebagai d-hemolisis.

Sitotoksin- enzim yang memiliki efek toksik pada sel target. Misalnya, sitotoksisitas toksin mikroorganisme anaerobik ditentukan dalam kultur sel. Untuk tujuan ini, 1 g bahan (feses atau lainnya) diencerkan dalam buffer fosfat 1:10 massa/volume, disentrifugasi selama 30 menit pada 4000 rpm. Supernatan disaring pada filter 2O nm, ditambahkan ke lapisan tunggal kultur sel McCoy dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam sampai efek toksik tercapai.

Penentuan imunokimia produksi toksin: sebagai aturan, metode imunosorben terkait-enzim digunakan untuk menentukan banyak eksotoksin - difteri, kolera, stafilokokus, dll. Untuk tujuan ini, sistem pengujian berdasarkan antibodi monoklonal terhadap eksotoksin tertentu digunakan.

Pasmokoagulase- enzim yang mengentalkan plasma darah hewan. Ditentukan dalam reaksi tabung reaksi. Dalam 1 ml plasma sitrat kelinci atau manusia (utuh atau diencerkan 2 dan 4 kali dengan garam), satu lingkaran kultur agar mikroba setiap hari diaduk. Campuran diinkubasi dalam termostat pada suhu 37°C. Dalam kasus positif, setelah 2-4 jam plasma menggumpal (muncul gumpalan). Lesitinase - lihat di atas.

Oksida reduktase:

1. Definisi oksidase. Potongan kultur uji diaplikasikan secara melingkar pada kertas saring yang dibasahi dengan larutan tetrametilparafenilendiamin 1%. Dalam kasus positif, warna ungu pada garis-garis muncul (dalam 1 menit).

2. Penentuan katalase. Setetes larutan hidrogen peroksida 3% dioleskan ke kaca objek dan satu lingkaran kultur uji dimasukkan di sana. Dengan adanya katalase, gelembung oksigen terbentuk.

3. Penentuan dehidrasi. Adanya dehidrasi dinilai dari kemampuan reduksi mikroba, yaitu kemampuan untuk mereduksi beberapa pewarna organik (misalnya, larutan metilen biru 1%). Pewarna (akseptor hidrogen) ditambahkan ke kolom agar gula (donor hidrogen) dan kultur mikroba diinokulasi dengan suntikan. Dalam kasus positif, mikroba yang tumbuh pada media tersebut akan mengubah warnanya.

4. Penentuan spektrum asam lemak rantai pendek (SCFA), Mikroorganisme anaerobik menghasilkan produk antara, termasuk asam lemak rantai pendek dan alkohol, yang spektrum (profilnya) berbeda pada berbagai jenis mikroorganisme dan memungkinkan identifikasi mikroorganisme hingga tingkat genus. Yang paling umum diuji adalah asam asetat, propionat, butil, isobutil, valerat, isovalerat, kaproat, dan isokaproat. Untuk menentukan SCFA digunakan metode kromatografi gas-cair. Mikroorganisme seperti actinomycetes, prolionibacteria, eubacteria, bifidobacteria, dan clostridia diidentifikasi.

Dalam beberapa tahun terakhir, laboratorium bakteriologi telah menggunakan sistem uji komersial untuk identifikasi biokimia cepat (menentukan aktivitas biokimia berbagai kelompok mikroorganisme): misalnya, uji 2O untuk enterobakteri dan uji ZO untuk anaerob. Skema identifikasi mencakup langkah-langkah berikut:

Koloni ---- Persiapan ---- Aplikasi ----- Inkubasi ---- Akuntansi (+ -) ---- Antar-

suspensi suspensi 4 jam presentasi 37°C pada hari Rabu

Sebagai bahan identifikasi, digunakan koloni yang terisolasi dengan baik pada piring atau kultur murni dalam tabung reaksi, dari mana suspensi dibuat dalam konsentrasi standar kepadatan optik N4, kemudian 55 μl suspensi ditambahkan ke dalam sumur. dengan media sistem tes ini. Piring dengan strip diinkubasi pada suhu 37°C selama 4 jam. Penghitungan dapat dilakukan secara otomatis (menggunakan perangkat ATV) atau secara visual.Hasil reaksi biokimia dinilai dalam bentuk “+” atau “-” dan dimasukkan tabel referensi yang hasil positifnya sesuai dengan ekspresi numerik. , menghasilkan profil numerik tertentu yang sesuai dengan indeks profil analitik yang dikembangkan secara khusus yang memungkinkan Anda mengidentifikasi satu atau lainnya dengan cepat

mikroorganisme.

77288 0

Sifat budaya bakteri

Sifat budaya (atau makromorfologi) meliputi ciri khas pertumbuhan mikroorganisme pada media nutrisi padat dan cair. Pada permukaan media nutrisi yang padat, tergantung pada pembibitannya, mikroorganisme dapat tumbuh dalam bentuk koloni, guratan atau halaman rumput yang terus menerus.

Koloni adalah kumpulan sel-sel terisolasi dari jenis yang sama yang tumbuh dari satu sel (klon sel). Tergantung di mana mikroorganisme tumbuh (pada permukaan media nutrisi padat atau ketebalannya), koloni permukaan, dalam dan bawah dibedakan.

Koloni yang tumbuh di permukaan medium beragam: spesifik untuk spesies dan studinya digunakan untuk menentukan spesies tanaman yang diteliti.

Saat mendeskripsikan koloni, karakteristik berikut diperhitungkan:
1) bentuk koloni - bulat, amoeboid, rizoid, tidak beraturan, dll;

2) ukuran (diameter) koloni - sangat kecil (runcing) (0,1-0,5 mm), kecil (0,5-3 mm), sedang (3-5 mm) dan besar (diameter lebih dari 5 mm);

3) permukaan koloni licin, kasar, terlipat, berkerut, berbentuk lingkaran konsentris atau lurik radial;

4) profil koloni - datar, cembung, berbentuk kerucut, berbentuk kawah, dll.;

5) transparansi - kusam, matte, mengkilat, transparan, berbentuk tepung;

6) warna koloni (pigmen) - tidak berwarna atau berpigmen (putih, kuning, emas, merah, hitam), terutama perhatikan pelepasan pigmen ke dalam medium dengan pewarnaannya;

7) tepi koloni - halus, bergelombang, bergerigi, berpohon, dll.;

8) struktur koloni - homogen, berbutir halus atau kasar, bergaris-garis; tepi dan struktur koloni ditentukan dengan menggunakan kaca pembesar atau mikroskop dengan perbesaran rendah dengan meletakkan cawan petri yang telah diinokulasi di atas meja mikroskop dengan tutupnya menghadap ke bawah;

9) konsistensi koloni; ditentukan dengan menyentuh permukaan dengan lingkaran: koloni bisa padat, lunak, tumbuh menjadi agar-agar, berlendir (membentang di belakang lingkaran), rapuh (mudah pecah jika bersentuhan dengan lingkaran).

Koloni yang dalam paling sering terlihat seperti lentil yang kurang lebih pipih (bentuk oval dengan ujung runcing), kadang-kadang gumpalan kapas dengan pertumbuhan seperti benang ke dalam media nutrisi. Pembentukan koloni yang dalam sering kali disertai dengan pecahnya medium padat jika mikroorganisme melepaskan gas.

Koloni bagian bawah biasanya terlihat seperti lapisan tipis transparan yang menyebar di sepanjang bagian bawah.

Ciri-ciri koloni dapat berubah seiring bertambahnya usia, bergantung pada komposisi media dan suhu budidaya.

Pertumbuhan mikroorganisme pada media nutrisi cair diperhitungkan dengan menggunakan kultur empat hingga tujuh hari yang ditanam dalam kondisi stasioner.

Dalam media nutrisi cair, ketika mikroorganisme tumbuh, kekeruhan media dan pembentukan lapisan atau sedimen diamati.

Ketika tumbuh pada media nutrisi semi-cair (0,5-0,7% agar), mikroba yang bergerak menyebabkan kekeruhan yang nyata, bentuk yang tidak bergerak hanya tumbuh selama disemai dengan cara disuntikkan ke dalam media.

Seringkali pertumbuhan mikroba disertai dengan munculnya bau, pigmentasi lingkungan, dan keluarnya gas. Bau khas kultur beberapa jenis bakteri dikaitkan dengan pembentukan berbagai ester (etil asetat, amil asetat, dll.), indole, merkaptan, hidrogen sulfida, skatole, amonia, asam butirat.

Kemampuan membentuk pigmen melekat pada banyak jenis mikroorganisme. Sifat kimiawi pigmen beragam: karotenoid, antosianin, melanin. Jika pigmen tidak larut dalam air, hanya plakat budaya yang ternoda; jika larut, media nutrisi juga menjadi berwarna. Pigmen diyakini melindungi bakteri dari efek berbahaya sinar matahari, itulah sebabnya ada begitu banyak bakteri berpigmen di udara; selain itu, pigmen terlibat dalam metabolisme mikroorganisme ini.

Di alam, ada yang disebut bakteri berpendar, yang kulturnya bersinar dalam gelap dengan cahaya kehijauan-kebiruan atau kekuningan. Bakteri tersebut banyak ditemukan di air sungai atau laut. Bakteri bercahaya - fotobakteri - termasuk bakteri aerob (vibrio, kokus, batang).

Isolasi kultur murni mikroorganisme

Kultur murni adalah kultur yang mengandung mikroorganisme dari spesies yang sama. Isolasi kultur murni bakteri merupakan tahap wajib dalam penelitian bakteriologis dalam praktik laboratorium, dalam studi kontaminasi mikroba pada berbagai objek lingkungan, dan secara umum dalam setiap pekerjaan dengan mikroorganisme.

Bahan yang diteliti (air, tanah, udara, makanan atau benda lain) biasanya mengandung asosiasi mikroba.

Isolasi suatu kultur murni memungkinkan untuk mempelajari ciri-ciri morfologi, kultur, biokimia, antigenik dan lainnya, yang totalitasnya menentukan spesies dan jenis patogen, yaitu identifikasinya dilakukan.

Untuk mengisolasi kultur murni mikroorganisme digunakan metode yang dapat dibagi menjadi beberapa kelompok:
1. Metode Pasteur - pengenceran berurutan bahan uji dalam media nutrisi cair hingga konsentrasi satu sel dalam volume (memiliki signifikansi historis).

2. Metode Koch (“pengkabelan pelat”) - pengenceran bahan uji secara berurutan dalam agar-agar cair (suhu 48-50 C), diikuti dengan menuangkan ke dalam cawan Petri, tempat agar-agar mengeras. Inokulasi biasanya dilakukan dari tiga atau empat pengenceran terakhir, di mana bakteri menjadi sedikit dan kemudian, saat mereka tumbuh di cawan Petri, muncul koloni terisolasi yang terbentuk dari satu sel induk awal. Dari koloni terisolasi jauh di dalam agar, kultur bakteri murni diperoleh dengan cara subkultur ke media segar.

3. Metode Shukevich - digunakan untuk memperoleh kultur murni Proteus dan mikroorganisme lain dengan pertumbuhan “merayap”. Bahan uji diinokulasi ke dalam air kondensasi di dasar miring agar. Mikroba yang bergerak (Proteus) mampu naik ke atas agar-agar yang miring, sedangkan bentuk-bentuk yang tidak bergerak tetap tumbuh di bawah, di tempat penaburan. Dengan menyemai kembali tepi atas kultur, Anda dapat memperoleh kultur murni.

4. Metode Drigalsky - banyak digunakan dalam praktek bakteriologis, dimana bahan yang diteliti diencerkan dalam tabung reaksi dengan larutan garam steril atau kaldu. Satu tetes bahan ditambahkan ke dalam cangkir pertama dan disebarkan ke permukaan media dengan spatula kaca steril. Kemudian, dengan spatula yang sama (tanpa membakarnya di api kompor), penaburan yang sama dilakukan pada gelas kedua dan ketiga.

Dengan setiap inokulasi bakteri, semakin sedikit bakteri yang tersisa di spatula, dan ketika disemai pada cangkir ketiga, bakteri akan tersebar di permukaan media nutrisi secara terpisah satu sama lain. Setelah 1-7 hari menyimpan cawan dalam termostat (tergantung pada laju pertumbuhan mikroorganisme), pada cawan ketiga, setiap bakteri menghasilkan klon sel, membentuk koloni terisolasi, yang disubkultur ke agar-agar miring agar terakumulasi. budaya yang murni.

5. Metode Weinberg. Kesulitan khusus timbul ketika mengisolasi kultur murni anaerob obligat. Jika kontak dengan oksigen molekuler tidak langsung menyebabkan kematian sel, maka penyemaian dilakukan sesuai metode Drigalsky, namun setelah itu cawan segera dimasukkan ke dalam anaerostat. Namun cara pembiakan lebih sering digunakan. Esensinya terletak pada kenyataan bahwa pengenceran bahan yang diteliti dilakukan dalam media nutrisi agar yang dicairkan dan didinginkan hingga 45-50 oC.

Pengenceran berturut-turut dilakukan sebanyak 6-10 kali, kemudian media dalam tabung reaksi didinginkan dengan cepat dan permukaannya ditutup dengan lapisan campuran parafin dan petroleum jelly untuk mencegah udara masuk ke dalam ketebalan media nutrisi. Kadang-kadang media nutrisi, setelah disemai dan dicampur, dipindahkan ke tabung Burri steril atau pipet kapiler Pasteur, yang ujungnya ditutup rapat. Dengan pengenceran yang berhasil, koloni anaerob yang terisolasi tumbuh di tabung reaksi, tabung Burri, dan pipet Pasteur. Untuk memastikan bahwa koloni yang diisolasi terlihat jelas, digunakan media nutrisi yang telah diklarifikasi.

Untuk mengekstraksi koloni anaerob yang terisolasi, tabung dipanaskan sedikit dengan cara diputar di atas api, sedangkan agar-agar yang berdekatan dengan dinding dicairkan dan isi tabung dalam bentuk kolom agar dikeluarkan ke dalam cawan petri steril. Kolom agar dipotong dengan pinset steril dan koloni dihilangkan dengan satu lingkaran. Koloni yang diekstraksi ditempatkan dalam media cair yang mendukung perkembangan mikroorganisme terisolasi. Media agar dikeluarkan dari tabung Burri dengan melewatkan gas melalui sumbat kapas.

6. Metode Hongaria. Ketika mereka ingin mendapatkan koloni bakteri terisolasi dengan sensitivitas tinggi terhadap oksigen (aerob ketat), metode tabung berputar Hungate digunakan. Untuk melakukan ini, media agar cair diinokulasi dengan bakteri pada arus konstan melalui tabung reaksi dengan gas inert yang bebas dari pengotor oksigen. Tabung kemudian ditutup dengan sumbat karet dan ditempatkan secara horizontal pada penjepit yang memutar tabung; medianya tersebar merata di dinding tabung reaksi dan mengeras menjadi lapisan tipis. Penggunaan lapisan tipis dalam tabung reaksi yang berisi campuran gas memungkinkan diperolehnya koloni terisolasi yang terlihat jelas dengan mata telanjang.

7. Isolasi sel individu menggunakan mikromanipulator. Mikromanipulator adalah perangkat yang memungkinkan Anda mengeluarkan satu sel dari suspensi menggunakan mikropipet khusus atau mikroloop. Operasi ini dikendalikan di bawah mikroskop. Sebuah ruang lembab dipasang pada panggung mikroskop, di mana sediaan tetes gantung ditempatkan. Mikropipet (micropoops) dipasang pada dudukan dudukan operasi, yang pergerakannya dalam bidang pandang mikroskop dilakukan dengan presisi mikron berkat sistem sekrup dan tuas. Peneliti, dengan melihat melalui mikroskop, mengeluarkan sel-sel individual dengan mikropipet dan memindahkannya ke dalam tabung yang berisi media cair steril untuk mendapatkan klon sel.

L.V. Timoschenko, M.V. Chubik

Apabila berdasarkan gejala tertentu pada tanaman dan hasil pemeriksaan mikroskopis diduga penyebab penyakit tersebut adalah bakteri, maka langkah selanjutnya adalah mengisolasinya.

Dalam hal ini diasumsikan bahwa patogen tersebut terkontaminasi dengan organisme penyertanya, yaitu terdapat populasi campuran. Untuk memperoleh patogen dalam bentuk koloni yang tumbuh terpisah, jaringan maserasi harus digoreskan pada media.

Menabur dengan satu sentuhan. Dengan menggunakan loop inokulasi yang telah dikalsinasi, ambil sedikit maserasi jaringan tanaman yang mengandung bakteri dan, dengan gerakan ringan, tanpa merusak permukaan agar, oleskan 4-6 sapuan pada media nutrisi yang telah disiapkan. Setelah loop dikalsinasi ulang, cawan dengan media diputar 90° ke kanan dan kemudian 4-6 pukulan lagi diterapkan dari pukulan kedua, jarum dikalsinasi lagi dan penaburan ketiga dilakukan. Hal ini menghasilkan pengenceran bahan awal sehingga bakteri, setelah inkubasi dalam termostat selama 48-72 jam pada suhu 28 °C, membentuk koloni individu dengan berbagai bentuk dan warna. Koloni kemudian dipindahkan ke tabung miring agar untuk pemeriksaan lebih lanjut. Dengan menggunakan calcined loop, ambil koloni dan aplikasikan pada nutrisi agar dengan gerakan hati-hati berbentuk ular atau zigzag.

Metode penuangan Koch. Metode pelat Koch memastikan bahwa setiap koloni terbentuk dari satu sel bakteri. Cara terbaik adalah menyiapkan suspensi dari bahan awal dalam air steril dan menggunakan metode Koch hanya dengan pengenceran ini. Sejumlah kecil suspensi dipindahkan ke dalam tabung reaksi pertama dengan media nutrisi yang didinginkan hingga 60 °C. Kemudian isi tabung dicampur dengan inokulum dengan cara diputar di antara kedua telapak tangan. Selanjutnya, ambil tabung reaksi kedua, buka dengan hati-hati di atas api pembakar, dan gunakan putaran besar untuk memindahkan tiga bagian substrat ke dalamnya dari tabung reaksi pertama. Setelah leher dan sumbatnya dibakar, isi tabung reaksi dituang ke dalam cawan Petri pertama, buka tutup cawan secukupnya untuk memasukkan leher tabung reaksi di bawahnya. Segera setelah dituang, tutup cangkir dan distribusikan media nutrisi secara merata.

Setelah isi tabung reaksi kedua tercampur rata, ambil tabung reaksi ketiga dan pindahkan enam bagian substrat dari tabung kedua ke dalamnya secara melingkar. Isi tabung reaksi dituangkan ke dalam cangkir, dan isi tabung reaksi setelah tercampur dituangkan ke dalam cangkir. Cawan berisi media diinkubasi dalam termostat pada suhu 28°C; setelah beberapa hari, bakteri yang terkandung dalam bahan awal membentuk koloni.

Pemuliaan serial. Jika, misalnya, perlu untuk mengisolasi bakteri dari tanah, maka digunakan pengenceran serial. Media nutrisi steril (15 ml per cangkir) dituangkan ke dalam cangkir, 0,1 ml dari tiga pengenceran terakhir suspensi diterapkan pada agar-agar yang mengeras dan disebarkan ke permukaan dengan spatula kaca.

Untuk mengisolasi bakteri, 1 g tanah disuspensikan dalam 9 ml air, dikocok dengan baik, didiamkan selama beberapa detik, dan pengenceran serial dibuat dari suspensi. Dengan menggunakan metode ini, jumlah mikroorganisme dalam setiap sampel dapat ditentukan.

Jika Anda menemukan kesalahan, silakan sorot sepotong teks dan klik Ctrl+Masuk.

Dalam serangkaian pengenceran sepuluh kali lipat berturut-turut dari sampel uji dari 2 pengenceran terakhir (derajat pengenceran tergantung pada jumlah CFU dalam 1 dosis obat uji), 0,1 ml suspensi mikroba ditaburkan pada cawan Petri yang berisi nutrisi. sedang (2 gelas untuk setiap pengenceran). Suspensi disebarkan secara merata ke seluruh permukaan media dengan menggunakan spatula Drigalski atau manik-manik kaca hingga suspensi terserap seluruhnya (kering). Piring ditutup dan ditempatkan terbalik dalam oven inkubasi.

Tanaman diinkubasi pada suhu (37  1) o C selama 24–96 jam dalam kondisi yang memadai, tergantung jenis mikroorganisme (aerob, mikroaerofilik, atau anaerobik). Saat diinkubasi dalam kondisi anaerobik atau mikroaerofilik, cawan petri berisi tanaman ditempatkan dalam anaerobik dan atmosfer gas yang diperlukan tercipta.

Cara ini dapat digunakan untuk mengetahui jumlah bakteri hidup masing-masing spesies dalam probiotik multikomponen, asalkan bakteri yang termasuk dalam sediaan membentuk koloni yang dapat dibedakan secara visual berdasarkan bentuk dan ciri lainnya.

1.2. Metode cangkir dalam

Dalam serangkaian pengenceran sepuluh kali lipat sampel uji berturut-turut dari 2 pengenceran terakhir (derajat pengenceran tergantung pada jumlah CFU dalam sediaan uji), 1,0 ml suspensi mikroba ditambahkan ke dalam cawan Petri dengan diameter 90 mm menggunakan pipet steril dengan kapasitas 1,0 ml (2 gelas untuk setiap pengenceran). Tambahkan 20–25 ml media nutrisi agar yang telah dicairkan dan didinginkan hingga suhu 42,5 ± 2,5 o C, tutup dan aduk cepat dengan hati-hati dengan gerakan memutar dan translasi, tanpa mengangkat bagian bawah cangkir dari permukaan meja dan mencegah media masuk. pada tutup cangkir. Setelah agar-agar mengeras, cawan Petri dibalik dan diinkubasi dalam kondisi yang memadai pada suhu (37  1) o C selama waktu yang dibutuhkan mikroorganisme tertentu.

Akuntansi untuk hasil

Pada akhir inkubasi, koloni yang tumbuh pada cawan Petri dihitung dan dihitung kandungan bakteri hidup dalam 1 dosis sampel uji. Saat menghitung, lempengan tempat setidaknya 15 koloni tumbuh diperhitungkan.

Contoh perhitungan kandungan sel mikroba hidup dalam 1 dosis sampel uji:

– dari pengenceran 10 -7, 42 dan 45 koloni tumbuh; mean aritmatikanya adalah (42+45): 2 = 43,5;

– dari pengenceran 10 -6, 410 dan 450 koloni tumbuh; mean aritmatikanya adalah (410+450) : 2 = 430;

– jumlah bakteri hidup dalam 1 dosis sama dengan:

(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .

Lipat gandakan rata-rata aritmatika jumlah koloni dengan derajat pengenceran dan, jika penyemaian pada cawan Petri dilakukan dalam volume 0,1 ml, kalikan dengan faktor 10 untuk mengubahnya menjadi 1,0 ml.

Metode pengenceran terbatas dilanjutkan dengan penyemaian pada media nutrisi cair dan semi cair

Metode tabung reaksi bilangan yang paling mungkin (menentukan jumlah Lactobacilli acidophilus yang hidup)

Dalam serangkaian pengenceran sepuluh kali lipat berturut-turut dari sampel uji 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 (derajat pengenceran tergantung pada jumlah CFU dalam sampel uji), 1 ml suspensi mikroba dari masing-masing sampel pengenceran diinokulasi ke dalam 2 tabung reaksi dengan 9 ml susu steril bebas lemak. Dicatat dari pengenceran mana tanaman itu dibuat. Pengenceran 10 -6 obat dalam larutan natrium klorida 0,9% sama dengan pengenceran 10 -6 dalam susu. Untuk mengontrol media, tambahkan 4 tabung reaksi yang tidak diinokulasi dengan susu. Tabung inokulasi dan kontrol diinkubasi pada suhu (38  1) 0 C selama 3–4 hari.

Pada akhir inkubasi, jumlah tabung reaksi dengan susu kental ditentukan. Apusan dibuat dari gumpalan kultur dan diwarnai dengan Gram. Jika ciri khas bakteri terlihat pada apusan dan tidak terdapat mikroflora asing, maka pengenceran tersebut dianggap mengandung mikroorganisme jenis tersebut. Dalam hal fermentasi susu dalam tabung kontrol dan jika mikroflora asing terdeteksi pada apusan, kontrol dilakukan pada media batch baru.

Akuntansi untuk hasil

Saat menghitung jumlah individu yang hidup, gunakan tabel McCready (Tabel 1). Pertama, karakteristik numerik dikompilasi. Terdiri dari 3 angka: pertama (di sebelah kiri) diberi angka yang sama dengan jumlah tabung reaksi yang berisi susu kental yang diambil pada pengenceran terakhir dimana susu mengental di semua tabung reaksi (misalnya 2 tabung reaksi pengenceran 10 -6).

Dua angka berikutnya menunjukkan jumlah tabung reaksi yang berisi susu kental pada 2 pengenceran berikutnya (misalnya dalam 1 tabung reaksi pengenceran 10 -7 dan dalam 1 tabung reaksi pengenceran 10 -8).

Karakteristik numerik dari hasilnya adalah 211.

Dengan menggunakan tabel McCready, temukan bilangan kemungkinan yang sesuai dengan karakteristik digital yang diperoleh (dalam kasus kami, 13), kalikan dengan pengenceran, yang sesuai dengan digit pertama dari karakteristik numerik (dalam contoh ini, 10 -6). Maka jumlah mikroorganisme hidup dalam 1 dosis adalah 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7.

Tabel 1 - Tabel McCready yang digunakan saat menghitung jumlah Lactobacilli acidophilus hidup

Karakteristik numerik	Jumlah mikroorganisme yang paling mungkin bila diinokulasi ke dalam 2 tabung paralel