Метод Пастера (метод предельных разведений). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред. К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре. С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке. Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала. Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха). Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов. После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

4. Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски.

5. Морфология бактерий. Отличия прокариотов от эукариотов. Основные формы бактерий.

6. Структура и функции поверхностных образований бактериальной клетки. Капсула. Методы выяв­ления.

7. Структура и функции клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Фор­мы бактерий с дефектами клеточной стенки.

8. Цитоппазматические структуры бактерий, функции, методы выявления. Кислотоустойчивые мик­робы. Метод окраски.

9. Покоящиеся формы микробов. Спорообразование у бактерий, стадии, методы выявления спор.

10. Подвижность бактерий, методы выявления подвижности.

11. Принципы систематики микробов. Систематическое положение микробов. Таксономические кате­гории. Понятие и критерии вида.

12-16. Систематическое положение и морфология спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, хламидий. Методы изучения.

18. Дыхательный аппарат бактерий. Пути биологического окисления. Классификация микробов по этому признаку

19 Способы размножения микробов. Механизм и фазы клеточного деления.

20. Характеристика бактериологического метода исследования

21. Питательные среды для аэробов и анаэробов. Требования, предъявляемые к питательным сре­дам, классификация.

22. Методы выделения чистых культур аэробов.

23. Методы выделения чистых культур анаэробов.

24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологиче­ская, генетическая.

26. Генетический аппарат бактерий (хромосомы, плазмиды) характеристика бактериальных транспозонов. Биологическая роль плазмид.

27. Виды изменчивости бактерий. Фенотипическая и генотипическая изменчивость. Понятие о популяционной изменчивости.

28. Мутационная изменчивость. Генетические рекомбинации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов. Понятие о генной инженерии и биотехнилогии.

29. Молекулярная диагностика. Цель. Задачи. Методы.

30. Молекулярная гибридизация. Полимеразная цепная реакция.

31. Учение об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Отличительные признаки инфекционных заболеваний. Типы инфекций.

32. Роль микроорганизма в инфекционном процессе. Патогенность и вирулентность Факторы патогенности.

33. Роль макроорганизма, физической и социальной среды в инфекционном процессе.

34. Биологический метод исследования задачи, оценка этапы.

35. Химиотерапия и химиопрофилактика. Антибиотики определение классификация.

36. Механизм действия антибиотиков.

37. Побочное действие антибиотиков.

38. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам.

39 Методы изучения чувствительности микробов к антибиотикам.

40. Экология микроорганизмов. Типы экологических связей.

41. Характеристика нормальной микрофлоры человека и ей биологическая роль. Методы изучения. Гнотобиология. Дисбактериоз. Причины развития, принципы коррекции.

42 Стерилизация, дезинфекция. Определение понятий, методы проведения.

43. Асептика, антисептика. Определение понятий. Способы проведения.

22. Методы выделения чистых культур аэробов.

Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микрсгскопиру-ют. Для посева исследуемый материал в случае необходимости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения нано­сят петлей на поверхность питательного агара в чашку Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку перевора­чивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18-24 ч.

Второй этап. Просматривают чашки и изучают изолиро­ванные колонии, обращая внимание на их форму, величину, кон­систенцию и другие признаки. Для определения морфологии кле­ток и их тинкториальных свойств из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для выделения и накопления чистой культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пе­ресевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого часть колонии сни­мают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап: Отмечают характер роста выделенной чис­той культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашен­ного мазка, приготовленного из такой культуры, в нем обнару­живаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Очнако в случае выраженного полиморфизма, присущего неко­торым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду с типичными встречаются и другие формы клеток.

23. Методы выделения чистых культур анаэробов.

Питательные среды для анаэробов должны отвечать следующим основным требованиям: 1) удовлетворять питательным потребно­стям; 2) обеспечивать быстрый рост микроорганизмов; 3) быть адек­ватно редуцированными

Посевы с целью выделения анаэробной микрофлоры, как спо-рообразующей (клостридии), так и неспорообразующей (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэроб­ных условиях. Первичные посевы делают на обогатительные сре­ды (тиогликолевую, Китта - Тароцци), затем пересевают на плотные среды: сахарный кровяной агар в чашки Петри, в высо­кий столбик сахарного питательного агара или другие среды для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий го­товят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта - Тароцци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразующих анаэробных бактерий (кло­стридии) первоначальные посевы прогревают на водяной бане при температуре 80 °С в течение 20 мин для уничтожения веге­тативных клеток посторонней микрофлоры, которая может при­сутствовать в исследуемом материале

24. Идентификация микроорганизмов морфологическая, культуральная серологическая, биологиче­ская, генетическая.

Идентификация – это определение систематического положения, выделение из какого-либо источника до уровня вида или варианта.

25. Биохимический метод идентификации: определение протеолитических. сахаролитических, липолитических свойств, выявление гемолизинов и оксидоредуктаз. Использование автоматических микробиологических анализаторов .

Этот метод предусматривает изучение ферментативной деградации различных субстратов (углеводов, аминокислот и белков, мочевины, перекиси водорода и др.) с образованием промежуточных и конечных

продуктов.

Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов. С этой целью используют следующие среды:

а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). В качестве последних используют реактив Андреде, бромтимоловый синий или ВР О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;

б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);

в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

Протеазы -ферменты, разлагающие белки:

а) исследуемая культура может расщеплять белки субстрата с образованием пептона, альбумоз, аминокислот. Этот процесс идет за счет ферментов-протеиназ и пептидаз. Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);

б)расщепление аминокислот микробами может идти путем декарбоксилирования, либо путем дезаминирования. В первом случае из той или иной аминокислоты образуются амины, которые выявляются либо методом элекрофореза. либо по подщелачиванию среды. О наличии дезаминаз у микроба судят по образованию аммиака в среде как результат процесса дезаминирования аминокислоты;

в) расщепление аминокислоты триптафана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;

г) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H2S, как Продукт расщепления этих аминокислот десульфуразами. Наличие H2S выявляется и в среде Олькеницкого;

д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид. В этих случаях при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.

Ферменты-токсины : Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают b-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, а-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как д-гемолиз.

Цитотоксины - ферменты, оказывающие токсический эффект на клетки мишени. Например, цитотоксичность токсина анаэробных микрорганизмов определяют на культуре клеток. С этой целью 1 г материала (испражнения или др.) разводят в фосфатном буфере 1:10 масса/объем, центрифугируют ЗО мин при 4ООО об/мин. Супернатант фильтруют на фильтре 2О нм, вносят в монослой культуры клеток МакКоя и инкубируют при 37°С 24-48 часов до достижения токсического эффекта.

Иммунохимическое определение продукции токсинов: используется, как правило, иммуноферментный метод определения многих экзотоксинов -дифтерийного, холерного, стафилококкового и др. Для этого применяются тест-системы на основе моноклональных антител к определенному экзотоксину.

Ппазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Определяют в пробирочной реакции. В1 мл цитратной плазмы кролика или человека (цельной или разведенной в 2 и 4 раза физраствором) размешивают петлю суточной агаровой культуры микроба. Смесь инкубируют в термостате при 37°С. В положительных случаях через 2-4 часа плазма свертывается (появляется сгусток). Лецитиназа - см. выше.

Оксидо-редуктазы:

1. Определение оксидаз . На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).

2. Определение каталазы . Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.

3. Определение дегидраз . О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки). К столбику сахарного агара (донатор водорода) добавляют краситель (акцептор водорода) и засевают микробную культуру уколом. В положительных случаях растущий на такой среде микроб ее обесцвечивает.

4. Определение спектра короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), Анаэробные микроорганизмы продуцируют промежуточные продукты, включающие короткоцепочечные жирные кислоты и спирты, спектр (профиль) которых различен у разных видов микроорганизмов и позволяет проводить идентификацию микроорганизмов до уровня рода. Наиболее часто исследуют уксусную, пропионовую, бутиловую, изобутиловую, валериановую, изовалериановую, капроновую и изокапроновую кислоты. Для определения КЦЖК используют метод газожидкостной хроматографии. Идентифицируют такие микроорганизмы как актиномицеты, пролионибактерии, эубактерии, бифидобактерии, клостридии.

В последние годы а бактериологических лабораториях применяются коммерческие тест-системы для быстрой биохимической идентификации (определение биохимической активности разных групп микроорганизмов): например, 2О тестов для энтеробактэрий и ЗО тестов для анаэробов. Схема идентификации включает следующие этапы:

Колонии ---- Приготовление ---- Внесение ----- Инкубация ---- Учет(+ -) ---- Интер-

суспензии суспензии 4 часа 37°С претация в среду

В качестве материала для идентификации используют хорошо изолированную колонию на чашке или чистую культуру в пробирке, из которой готовят суспензию в концентрации стандарта оптической плотности N4, затем по 55 мкл суспензии вносят в лунки со средами данной тест-системы. Планшета со стрипами инкубируется при 37°С 4 часа. Учет может осуществляться автоматически (используя прибор "АТВ") или визуально Результат биохимической реакции оценивают в виде "+" или "-" и вносят о референс-таблицу, в которой положительному результату соответствует численное выражение, в результате чего получается определенный числовой профиль, соответствующий специапьно разработанному индексу аналитического профиля, позволяющему быстро идентифицировать тот ипи иной

микроорганизм.

77288 0

Культуральные свойства бактерий

К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.

При описании колоний учитывают следующие признаки:
1) форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

2) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

3) поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

4) профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

5) прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

6) цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

7) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

8) структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.

Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.

Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:
1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Если на основании определенных симптомов на растениях и по результатам микроскопического исследования возникло предположение, что возбудителем болезни является бактерия, следующим шагом должно быть ее выделение.

При этом исходят из того, что возбудитель загрязнен сопутствующими организмами, т. е. налицо смешанная популяция. Чтобы получить возбудителя в виде отдельной растущей колонии, мацерат ткани следует посеять на среду штрихом.

Посев штрихом . Прокаленной инокуляционной петлей берут небольшое количество содержащего бактерии мацерата растительной ткани и легкими движениями, не повреждая поверхности агара, наносят на подготовленную питательную среду 4-6 штрихами. Повторно прокалив петлю, чашку со средой поворачивают на 90° вправо и затем от второго штриха наносят еще 4-6 штрихов, вновь прокаливают иглу и проводят третий посев. Этим достигается такое разведение исходного материала, при котором бактерии после инкубации в термостате в течение 48-72 ч при 28 °С формируют отдельные колонии различной формы и окраски. Затем колонии переносят для дальнейшего исследования в пробирки с косым агаром. Прокаленной петлей берут колонию и осторожным движением в виде змейки или зигзага наносят на питательный агар.

Метод разлива в чашки по Коху . Метод разлива в чашки по Коху обеспечивает формирование каждой колонии из одной единственной бактериальной клетки. Лучше всего приготовить из исходного материала суспензию в стерильной воде и применять метод Коха только с этим разведением. Небольшое количество суспензии переносят в первую пробирку с питательной средой, охлажденной до 60 °С. Затем содержимое пробирки перемешивают с инокулюмом, вращая ее между ладонями. Далее, берут вторую пробирку, осторожно открывают над пламенем горелки и большими петлями переносят в нее из первой пробирки три порции субстрата. Содержимое пробирки после обжига горлышка и пробки выливают в первую чашку Петри, приоткрывая крышку чашки ровно настолько, чтобы ввести под нее горлышко пробирки. Сразу после выливания чашку закрывают и осторожными движениями равномерно распределяют питательную среду.

Тщательно перемешав содержимое второй пробирки, берут третью пробирку и петлей переносят в нее из второй шесть порций субстрата. Содержимое пробирки выливают в чашку, а содержимое пробирки после перемешивания - в чашку. Чашки со средой инкубируют в термостате при 28°С, через несколько дней содержавшиеся в исходном материале бактерии формируют колонии.

Последовательное разведение . Если, например, необходимо изолировать бактерии из почвы, то используют последовательное разведение. Стерильную питательную среду (15 мл на чашку) разливают по чашкам, на затвердевший агар наносят по 0,1 мл последних трех разведений суспензии и стеклянным шпателем распределяют по поверхности.

Для выделения бактерий 1 г почвы суспендируют в 9 мл воды, хорошо взбалтывают, дают несколько секунд отстояться и из суспензии готовят последовательные разведения. С помощью этого метода можно определить число микроорганизмов в каждой пробе.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.

Посевы инкубируют при температуре (37  1) о С в течение 24–96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.

Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.

1.2. Глубинный чашечный метод

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20–25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 ± 2,5 о С агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37  1) о С в течение необходимого для данного микроорганизма времени.

Учет результатов

По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.

Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:

– из разведения 10 -7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42+45) : 2 = 43,5;

– из разведения 10 -6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410+450) : 2 = 430;

– количество живых бактерий в 1 дозе равно:

(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .

Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды

Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 , 10 -9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10 -6 препарата в 0,9 % растворе натрия хлорида соответствует разведению 10 -6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38  1) 0 С в течение 3–4 сут.

По окончании инкубацииопределяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.

Учет результатов

При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10 -6).

Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10 -7 и в 1 пробирке разведения 10 -8).

Числовая характеристика результата будет 211.

По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере – 10 -6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7 .

Таблица 1  Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий

Числовая характеристика	Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки