Μέθοδος Παστέρ (μέθοδος περιοριστικής αραίωσης).Συνίσταται στην πραγματοποίηση μιας σειράς διαδοχικών αραιώσεων από το υπό μελέτη υλικό σε ένα υγρό θρεπτικό μέσο. Για να γίνει αυτό, μια σταγόνα ενοφθαλμίσματος εισάγεται σε δοκιμαστικό σωλήνα με αποστειρωμένο υγρό μέσο, ​​η σταγόνα από αυτό μεταφέρεται στον επόμενο δοκιμαστικό σωλήνα και ενοφθαλμίζονται με αυτόν τον τρόπο έως και 8...10 δοκιμαστικοί σωλήνες. Με κάθε αραίωση, ο αριθμός των μικροβιακών κυττάρων που εισέρχονται στο μέσο θα μειώνεται και είναι δυνατόν να ληφθεί μια τέτοια αραίωση στην οποία σε ολόκληρο τον δοκιμαστικό σωλήνα με το μέσο θα υπάρχει μόνο ένα μικροβιακό κύτταρο, από το οποίο θα γίνεται καθαρή καλλιέργεια του μικροοργανισμού. αναπτύσσω. Δεδομένου ότι τα μικρόβια αναπτύσσονται διάχυτα σε υγρά μέσα, δηλ. κατανέμονται εύκολα σε όλο το περιβάλλον, είναι δύσκολο να απομονωθεί ένα μικροβιακό κύτταρο από ένα άλλο. Έτσι, η μέθοδος του Παστέρ δεν παρέχει πάντα μια καθαρή κουλτούρα. Ως εκ τούτου, επί του παρόντος, αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται κυρίως για την προκαταρκτική μείωση της συγκέντρωσης μικροοργανισμών στο υλικό πριν από τον εμβολιασμό του σε ένα στερεό μέσο για τη λήψη απομονωμένων αποικιών.

Μέθοδοι μηχανικού διαχωρισμού μικροοργανισμών με χρήση στερεών θρεπτικών μέσων.Τέτοιες μέθοδοι περιλαμβάνουν τη μέθοδο Koch και τη μέθοδο Drigalski.

Μέθοδος Koch (μέθοδος βαθιάς σποράς).Το υλικό δοκιμής εισάγεται με βακτηριολογικό βρόχο ή πιπέτα Pasteur σε δοκιμαστικό σωλήνα με λιωμένο πυκνό θρεπτικό μέσο. Ανακατέψτε το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα ομοιόμορφα περιστρέφοντάς τον ανάμεσα στις παλάμες σας. Μια σταγόνα από το αραιωμένο υλικό μεταφέρεται στον δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα, από τον δεύτερο στον τρίτο κ.λπ. Το περιεχόμενο κάθε δοκιμαστικού σωλήνα, ξεκινώντας από τον πρώτο, χύνεται σε αποστειρωμένα τρυβλία Petri. Αφού στερεοποιηθεί το μέσο στα πιάτα, τοποθετούνται σε θερμοστάτη για καλλιέργεια.

Για την απομόνωση αναερόβιων μικροοργανισμών με τη μέθοδο Koch, είναι απαραίτητο να περιοριστεί η πρόσβαση οξυγόνου στην καλλιέργεια. Για το σκοπό αυτό, η επιφάνεια της βαθιάς σποράς σε ένα τρυβλίο Petri γεμίζεται με ένα αποστειρωμένο μείγμα παραφίνης και βαζελίνης (1:1). Μπορείτε επίσης να αφήσετε το εμβόλιο, αναμεμειγμένο καλά με το μέσο άγαρ, απευθείας στον δοκιμαστικό σωλήνα. Σε αυτή την περίπτωση, το βαμβακερό πώμα αντικαθίσταται με ένα ελαστικό ή η επιφάνεια του άγαρ γεμίζεται με ένα μείγμα παραφίνης και βαζελίνης. Για να εξαχθούν οι αναπτυγμένες αποικίες των αναερόβιων μικροοργανισμών, οι σωλήνες θερμαίνονται ελαφρά περιστρέφοντας γρήγορα πάνω από τη φλόγα του καυστήρα. Το άγαρ δίπλα στα τοιχώματα λιώνει και η στήλη γλιστράει εύκολα στο προετοιμασμένο πιάτο Petri. Στη συνέχεια, η στήλη άγαρ κόβεται με αποστειρωμένο νυστέρι, οι αποικίες αφαιρούνται με αποστειρωμένο βρόχο ή αποστειρωμένο τριχοειδή κόφτη και μεταφέρονται σε υγρό μέσο.

Μέθοδος Drigalskiβασίζεται στον μηχανικό διαχωρισμό μικροβιακών κυττάρων στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου σε τρυβλία Petri. Κάθε μικροβιακό κύτταρο, στερεώνοντας τον εαυτό του σε ένα συγκεκριμένο μέρος, αρχίζει να πολλαπλασιάζεται, σχηματίζοντας μια αποικία.

Για τη σπορά με τη μέθοδο Drygalsky, χρησιμοποιούνται πολλά πιάτα Petri γεμάτα με ένα πυκνό θρεπτικό μέσο. Μια σταγόνα του υλικού δοκιμής τοποθετείται στην επιφάνεια του μέσου. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη σπάτουλα, αυτή η σταγόνα κατανέμεται σε όλο το θρεπτικό μέσο (σπορά γκαζόν).

Η σπορά μπορεί να γίνει και με ραβδώσεις χρησιμοποιώντας βακτηριολογική θηλιά. Η ίδια σπάτουλα ή θηλιά χρησιμοποιείται για τη σπορά του δεύτερου, του τρίτου κ.λπ. φλιτζάνια. Κατά κανόνα, στο πρώτο φλιτζάνι μετά την καλλιέργεια του σπόρου, η μικροβιακή ανάπτυξη εμφανίζεται με τη μορφή συνεχούς επικάλυψης στα επόμενα κύπελλα, η περιεκτικότητα σε μικροοργανισμούς μειώνεται και σχηματίζονται απομονωμένες αποικίες, από τις οποίες μπορεί εύκολα να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια. .

Έτσι, στους πρώτους τομείς, επιτυγχάνεται συνεχής ανάπτυξη, και κατά τη διάρκεια των επόμενων εγκεφαλικών επεισοδίων, θα αναπτυχθούν απομονωμένες αποικίες, που αντιπροσωπεύουν τους απογόνους ενός κυττάρου.

Για να εξοικονομήσετε μέσα και σκεύη, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα φλιτζάνι, χωρίζοντάς το σε τομείς και να τα σπείρετε διαδοχικά με μια ράβδο (μέθοδος εξάντλησης ραβδώσεων). Για να το κάνετε αυτό, πάρτε το υλικό σε ένα βρόχο και σχεδιάστε μια σειρά παράλληλων πινελιών με αυτό, πρώτα κατά μήκος της επιφάνειας του πρώτου τομέα και, στη συνέχεια, βάλτε διαδοχικά όλους τους άλλους τομείς με τα κελιά που παραμένουν στον βρόχο. Με κάθε επόμενο εγκεφαλικό επεισόδιο, ο αριθμός των σπαρμένων κυττάρων μειώνεται.

Μέθοδος απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών με χρήση χημικώνχρησιμοποιείται για την απομόνωση καλλιεργειών μικροοργανισμών ανθεκτικών σε ορισμένες χημικές ουσίες. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο είναι δυνατό να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια φυματιωδών μυκοβακτηρίων που είναι ανθεκτικά σε οξέα, αλκάλια και αλκοόλ. Στην περίπτωση αυτή, το υπό μελέτη υλικό γεμίζεται με διάλυμα οξέος 15% ή αντιφορμίνη πριν από τη σπορά και διατηρείται σε θερμοστάτη για 3...4 ώρες. Μετά την έκθεση σε οξύ ή αλκάλιο, τα κύτταρα του βάκιλου της φυματίωσης παραμένουν ζωντανά και όλοι οι άλλοι μικροοργανισμοί που περιέχονται στο υλικό δοκιμής πεθαίνουν. Μετά την εξουδετέρωση του οξέος ή του αλκαλίου, το κατεργασμένο υλικό σπέρνεται σε στερεό μέσο και λαμβάνονται απομονωμένες αποικίες του παθογόνου παράγοντα της φυματίωσης.

4. Διαφορικές διαγνωστικές μέθοδοι χρώσης μικροβίων. Χρώση κατά Gram, μηχανισμός και τεχνική χρώσης.

5. Μορφολογία βακτηρίων. Διαφορές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών. Βασικές μορφές βακτηρίων.

6. Δομή και λειτουργίες επιφανειακών σχηματισμών ενός βακτηριακού κυττάρου. Κάψουλα. Μέθοδοι ανίχνευσης.

7. Δομή και λειτουργίες του κυτταρικού τοιχώματος των gram-θετικών και gram-αρνητικών βακτηρίων. Μορφές βακτηρίων με ελαττώματα κυτταρικού τοιχώματος.

8. Κυτταροπασματικές δομές βακτηρίων, λειτουργίες, μέθοδοι ανίχνευσης. Τα οξέα μικρόβια. Μέθοδος χρωματισμού.

9. Μορφές ανάπαυσης μικροβίων. Σπορίωση σε βακτήρια, στάδια, μέθοδοι αναγνώρισης σπορίων.

10. Κινητικότητα βακτηρίων, μέθοδοι ανίχνευσης κινητικότητας.

11. Αρχές μικροβιακής ταξινόμησης. Συστηματική θέση μικροβίων. Ταξινομικές κατηγορίες. Έννοια και κριτήρια του τύπου.

12-16. Συστηματική θέση και μορφολογία σπειροχαιτών, ακτινομυκήτων, μυκοπλασμάτων, ρικέτσιων, χλαμυδίων. Μέθοδοι μελέτης.

18. Αναπνευστική συσκευή βακτηρίων. Μονοπάτια βιολογικής οξείδωσης. Ταξινόμηση μικροβίων σύμφωνα με αυτό το κριτήριο

19 Μέθοδοι αναπαραγωγής μικροβίων. Μηχανισμός και φάσεις κυτταρικής διαίρεσης.

20. Χαρακτηριστικά της μεθόδου βακτηριολογικής έρευνας

21. Θρεπτικά μέσα για αερόβια και αναερόβια. Απαιτήσεις για θρεπτικά μέσα, ταξινόμηση.

22. Μέθοδοι απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών αερόβιων.

23. Μέθοδοι απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών αναερόβιων.

24. Ταυτοποίηση μικροοργανισμών μορφολογικά, πολιτισμικά ορολογικά, βιολογικά, γενετικά.

26. Γενετική συσκευή βακτηρίων (χρωμοσώματα, πλασμίδια) χαρακτηριστικά βακτηριακών τρανσποζονίων. Βιολογικός ρόλος των πλασμιδίων.

27. Τύποι μεταβλητότητας βακτηρίων. Φαινοτυπική και γονοτυπική μεταβλητότητα. Η έννοια της μεταβλητότητας του πληθυσμού.

28. Μεταλλακτική μεταβλητότητα. Γενετικοί ανασυνδυασμοί. Πρακτική σημασία της μεταβλητότητας των μικροοργανισμών. Η έννοια της γενετικής μηχανικής και της βιοτεχνολογίας.

29. Μοριακή διαγνωστική. Στόχος. Καθήκοντα. Μέθοδοι.

30. Μοριακός υβριδισμός. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης.

31. Το δόγμα της μόλυνσης. Προϋποθέσεις για την εμφάνιση μιας μολυσματικής διαδικασίας. Διακριτικά σημάδια μολυσματικών ασθενειών. Τύποι λοιμώξεων.

32. Ο ρόλος των μικροοργανισμών στη λοιμώδη διαδικασία. Παθογένεια και λοιμογόνος δράση Παράγοντες παθογένειας.

33. Ο ρόλος του μακροοργανισμού, του φυσικού και κοινωνικού περιβάλλοντος στη λοιμώδη διαδικασία.

34. Βιολογική μέθοδος έρευνας του προβλήματος, στάδια αξιολόγησης.

35. Χημειοθεραπεία και χημειοπροφύλαξη. Ταξινόμηση ορισμού αντιβιοτικών.

36. Μηχανισμός δράσης αντιβιοτικών.

37. Παρενέργειες των αντιβιοτικών.

38. Αντοχή μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά.

39 Μέθοδοι για τη μελέτη της ευαισθησίας των μικροβίων στα αντιβιοτικά.

40. Οικολογία μικροοργανισμών. Τύποι περιβαλλοντικών συνδέσεων.

41. Χαρακτηριστικά της φυσιολογικής ανθρώπινης μικροχλωρίδας και ο βιολογικός της ρόλος. Μέθοδοι μελέτης. Γνωτοβιολογία. Δυσβακτηρίωση. Αιτίες ανάπτυξης, αρχές διόρθωσης.

42 Αποστείρωση, απολύμανση. Ορισμός εννοιών, μέθοδοι υλοποίησης.

43. Ασηψία, αντισηπτικά. Ορισμός εννοιών. Μέθοδοι διεξαγωγής.

22. Μέθοδοι απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών αερόβιων.

Η διαδικασία απομόνωσης μιας καθαρής καλλιέργειας μπορεί να χωριστεί σε διάφορα στάδια.

Πρώτο στάδιο. Παρασκευάζεται επίχρισμα από το υλικό που εξετάζεται, χρωματίζεται με Gram ή άλλη μέθοδο και αντιγράφεται μικροσκοπικά. Για τον εμβολιασμό, το υλικό δοκιμής, εάν είναι απαραίτητο, αραιώνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα με στείρο ισοτονικό διάλυμα χλωριούχου νατρίου. Μία σταγόνα από την προετοιμασμένη αραίωση εφαρμόζεται σε θηλιά στην επιφάνεια του θρεπτικού άγαρ σε ένα τρυβλίο Petri και τρίβεται καλά στο μέσο με μια σπάτουλα, κατανέμοντας ομοιόμορφα το υλικό σε ολόκληρη την επιφάνειά του. Μετά τη σπορά, το κύπελλο αναποδογυρίζεται, επισημαίνεται και τοποθετείται σε θερμοστάτη θερμοκρασίας 37 °C για 18-24 ώρες.

Δεύτερη φάση. Κοιτάζουν τα πιάτα και μελετούν απομονωμένες αποικίες, δίνοντας προσοχή στο σχήμα, το μέγεθος, τη συνοχή και άλλα χαρακτηριστικά τους. Για να προσδιοριστεί η μορφολογία των κυττάρων και οι χρωστικές τους ιδιότητες, παρασκευάζεται επίχρισμα από τμήμα της υπό μελέτη αποικίας, χρωματίζεται με Gram και εξετάζεται σε μικροσκόπιο. Για να απομονωθεί και να συσσωρευτεί μια καθαρή καλλιέργεια, μια απομονωμένη αποικία ή πολλές διαφορετικές απομονωμένες αποικίες υποκαλλιεργούνται σε χωριστούς σωλήνες με λοξό άγαρ ή κάποιο άλλο θρεπτικό μέσο. Για να γίνει αυτό, ένα μέρος της αποικίας αφαιρείται με βρόχο, χωρίς να αγγίζει τις γειτονικές αποικίες.

Τρίτο στάδιο: Σημειώνεται το πρότυπο ανάπτυξης της απομονωμένης καθαρής καλλιέργειας. Μια οπτικά καθαρή καλλιέργεια χαρακτηρίζεται από ομοιόμορφη ανάπτυξη. Η μικροσκοπική εξέταση ενός κηλιδωμένου επιχρίσματος που παρασκευάστηκε από μια τέτοια καλλιέργεια αποκαλύπτει μορφολογικά και χρωματικά ομοιογενή κύτταρα. Ωστόσο, στην περίπτωση έντονου πολυμορφισμού που είναι εγγενής σε ορισμένους τύπους βακτηρίων, σε επιχρίσματα από καθαρή καλλιέργεια, μαζί με τα τυπικά, εντοπίζονται και άλλες μορφές κυττάρων.

23. Μέθοδοι απομόνωσης καθαρών καλλιεργειών αναερόβιων.

Τα θρεπτικά μέσα για αναερόβια πρέπει να πληρούν τις ακόλουθες βασικές απαιτήσεις: 1) να καλύπτουν τις διατροφικές ανάγκες. 2) εξασφάλιση της ταχείας ανάπτυξης των μικροοργανισμών. 3) να μειωθεί επαρκώς

Οι εμβολιασμοί για την απομόνωση της αναερόβιας μικροχλωρίδας, τόσο που σχηματίζει σπόρους (κλωστρίδια) όσο και που δεν σχηματίζουν σπόρους (veillonella, βακτηριοειδείς, πεπτόκοκκοι), πραγματοποιούνται υπό αυστηρά αναερόβιες συνθήκες. Οι πρωτογενείς εμβολιασμοί γίνονται σε μέσα εμπλουτισμού (θειογλυκολικό, Kitta - Tarozzi), στη συνέχεια υποκαλλιεργούνται σε στερεά μέσα: άγαρ σακχάρου αίματος σε τρυβλία Petri, σε στήλη υψηλής περιεκτικότητας σε θρεπτικό άγαρ ζάχαρης ή άλλα μέσα για τη λήψη απομονωμένων αποικιών. Μετά την επώαση των καλλιεργειών υπό αναερόβιες συνθήκες, παρασκευάζονται επιχρίσματα από τις προκύπτουσες βακτηριακές αποικίες, χρωματίζονται, υποβάλλονται σε μικροσκόπιο και στη συνέχεια υποκαλλιεργούνται σε μέσο Kitt-Tarozzi και μέσα άγαρ για να απομονωθεί μια καθαρή καλλιέργεια.

Κατά την απομόνωση αναερόβιων βακτηρίων που σχηματίζουν σπόρους (κλοστρίδια), οι αρχικοί εμβολιασμοί θερμαίνονται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 80 °C για 20 λεπτά για να καταστραφούν βλαστικά κύτταρα ξένης μικροχλωρίδας που μπορεί να υπάρχει στο υλικό δοκιμής.

24. Ταυτοποίηση μικροοργανισμών μορφολογικά, πολιτισμικά ορολογικά, βιολογικά, γενετικά.

Ταυτοποίηση είναι ο προσδιορισμός μιας συστηματικής θέσης, ο διαχωρισμός από οποιαδήποτε πηγή στο επίπεδο ενός είδους ή μιας παραλλαγής.

25. Μέθοδος βιοχημικής ταυτοποίησης: προσδιορισμός πρωτεολυτικού. σακχαρολυτικές, λιπολυτικές ιδιότητες, ταυτοποίηση αιμολυσινών και οξειδορεδουκτασών. Χρήση αυτόματων μικροβιολογικών αναλυτών .

Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει τη μελέτη της ενζυμικής αποικοδόμησης διαφόρων υποστρωμάτων (υδατάνθρακες, αμινοξέα και πρωτεΐνες, ουρία, υπεροξείδιο του υδρογόνου κ.λπ.) με το σχηματισμό ενδιάμεσων και τελικών

προϊόντα.

Υδατάνθρακες- ένζυμα που αποσυνθέτουν τους υδατάνθρακες. Με τον προσδιορισμό των υδατανθράκων, τα λεγόμενα σακχαρολυτικές ιδιότητες μικροβίων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα περιβάλλοντα:

α) Μέσα συρραφής (υγρό και ημί-υγρό με δείκτες). Τα τελευταία χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήριο Andrede, μπλε βρωμοθυμόλης ή BP. Η ενζυματική δραστηριότητα των βακτηρίων κρίνεται από την αλλαγή στο χρώμα του μέσου και το σχηματισμό αερίου.

β) διαφορικά διαγνωστικά μέσα με λακτόζη (Endo, Levina, Ploskireva, κ.λπ.).

γ) πολυυδατανθρακικά μέσα (όπως Olkenitsky, Kligler, κ.λπ.).

Πρωτεάσες-ένζυμα που αποσυνθέτουν τις πρωτεΐνες:

α) η υπό μελέτη καλλιέργεια μπορεί να διασπάσει τις πρωτεΐνες του υποστρώματος με το σχηματισμό πεπτόνης, λευκωματίνης και αμινοξέων. Αυτή η διαδικασία συμβαίνει λόγω των ενζύμων πρωτεϊνάσες και πεπτιδάσες. Για τον εντοπισμό αυτών των ενζύμων, η υπό μελέτη καλλιέργεια ενοφθαλμίζεται σε διάφορα μέσα: θρομβωμένος ορός γάλακτος, στήλη ζελατίνης (ρευστοποίηση σε θετικές περιπτώσεις), άγαρ γάλακτος σε τρυβλίο Petri (σε θετικές περιπτώσεις εμφανίζονται ζώνες θολότητας γύρω από τις αποικίες) ;

β) η διάσπαση των αμινοξέων από μικρόβια μπορεί να συμβεί μέσω αποκαρβοξυλίωσης ή απαμίνωσης. Στην πρώτη περίπτωση, από το ένα ή το άλλο αμινοξύ σχηματίζονται αμίνες, οι οποίες ανιχνεύονται είτε με ηλεκτροφόρηση. ή με αλκαλοποίηση του μέσου. Η παρουσία απαμινασών σε ένα μικρόβιο κρίνεται από το σχηματισμό αμμωνίας στο μέσο ως αποτέλεσμα της διαδικασίας απαμίνωσης αμινοξέων.

γ) η διάσπαση του αμινοξέος τρυπταφάνη λόγω της δράσης του ενζύμου τρυπταφανάση συνοδεύεται από το σχηματισμό ινδόλης. Το τελευταίο ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας ένα κομμάτι χαρτιού βρεγμένο με οξαλικό οξύ και στερεωμένο κάτω από ένα πώμα πάνω από το θρεπτικό μέσο. Σε θετικές περιπτώσεις, το κομμάτι χαρτί γίνεται κόκκινο.

δ) για τον εντοπισμό ενζύμων για τη διάσπαση των αμινοξέων που περιέχουν θείο (κυστίνη, κυστεΐνη), πραγματοποιούνται δοκιμές για H2S, ως προϊόν της διάσπασης αυτών των αμινοξέων από τις δεσουλφουράσες. Η παρουσία H2S ανιχνεύεται επίσης στο περιβάλλον του Olkenitsky.

ε) για την αναγνώριση της ουρεάσης, ένα ένζυμο που διασπά την ουρία, ουρία και ένας δείκτης προστίθενται στο θρεπτικό μέσο σε ουδέτερο pH. Σε θετικές περιπτώσεις, το μέσο αλλάζει χρώμα λόγω μετατόπισης του pH προς την αλκαλική πλευρά λόγω του σχηματισμού αμμωνίας. Λιπάσες- ένζυμα για την αποσύνθεση λιπιδίων και λιπιδίων. Τις περισσότερες φορές, η λεκιθινάση προσδιορίζεται με επίστρωση σε άγαρ κρόκου. Η λεκιθινάση διασπά τη λεκιθίνη σε φωσφοχολίνη και διγλυκερίδιο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, καθώς αυξάνονται οι αποικίες, εμφανίζονται ιριδίζουσες ζώνες γύρω τους, αντανακλώντας τη δραστηριότητα της λεκιθινάσης.

Ένζυμα τοξινών : Οι αιμολυσίνες είναι ένζυμα που διασπούν τη φωσφολιπιδική μεμβράνη των ερυθροκυττάρων. Ανιχνεύονται με ενοφθαλμισμό της καλλιέργειας σε άγαρ αίματος (5-10%). Υπάρχουν β-αιμόλυση ή πλήρης αιμόλυση, όταν σχηματίζονται ζώνες καθαρισμού γύρω από τις αποικίες, α-αιμόλυση, ατελής αιμόλυση, όταν υπάρχουν πράσινες ζώνες γύρω από τις αποικίες. Η απουσία αιμόλυσης αναφέρεται ως d-αιμόλυση.

Κυτταροτοξίνες- ένζυμα που έχουν τοξική επίδραση στα κύτταρα στόχους. Για παράδειγμα, η κυτταροτοξικότητα της τοξίνης των αναερόβιων μικροοργανισμών προσδιορίζεται σε κυτταρική καλλιέργεια. Για το σκοπό αυτό, 1 g υλικού (περιττώματα ή άλλο) αραιώνεται σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 1:10 μάζα/όγκο, φυγοκεντρείται για 30 λεπτά στις 4000 rpm. Το υπερκείμενο διηθείται σε ένα φίλτρο 20 nm, προστίθεται σε μια μονοστιβάδα κυτταρικής καλλιέργειας McCoy και επωάζεται στους 37°C για 24-48 ώρες έως ότου επιτευχθεί τοξικό αποτέλεσμα.

Ανοσοχημικός προσδιορισμός της παραγωγής τοξίνης: κατά κανόνα, χρησιμοποιείται μια ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδος για τον προσδιορισμό πολλών εξωτοξινών - διφθερίτιδας, χολέρας, σταφυλοκοκκικών κ.λπ.

Πασμοκοαγουλάση- ένα ένζυμο που πήζει το πλάσμα του αίματος των ζώων. Προσδιορίζεται σε αντίδραση δοκιμαστικού σωλήνα. Σε 1 ml πλάσματος κιτρικού κουνελιού ή ανθρώπου (ολόκληρο ή αραιωμένο 2 και 4 φορές με φυσιολογικό ορό), αναδεύεται ένας βρόχος ημερήσιας καλλιέργειας άγαρ του μικροβίου. Το μίγμα επωάζεται σε θερμοστάτη στους 37°C. Σε θετικές περιπτώσεις, μετά από 2-4 ώρες το πλάσμα πήζει (εμφανίζεται θρόμβος). Λεκιθινάση - βλέπε παραπάνω.

Οξειδοαναγωγάσες:

1. Ορισμός οξειδάσες. Οι λωρίδες της δοκιμαστικής καλλιέργειας εφαρμόζονται σε θηλιά σε διηθητικό χαρτί βρεγμένο με διάλυμα τετραμεθυλπαραφαινυλενοδιαμίνης 1%. Σε θετική περίπτωση, εμφανίζεται βιολετί χρωματισμός των λωρίδων (μέσα σε 1 λεπτό).

2. Προσδιορισμός καταλάσης. Μια σταγόνα διαλύματος υπεροξειδίου του υδρογόνου 3% εφαρμόζεται σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα και ένας βρόχος της καλλιέργειας δοκιμής εισάγεται εκεί. Παρουσία καταλάσης, σχηματίζονται φυσαλίδες οξυγόνου.

3. Προσδιορισμός αφυδρασών. Η παρουσία αφυδρασών κρίνεται από την αναγωγική ικανότητα του μικροβίου, δηλ. ικανότητα μείωσης ορισμένων οργανικών χρωστικών (για παράδειγμα, 1% υδατικό διάλυμα μπλε του μεθυλενίου). Μια χρωστική (δέκτης υδρογόνου) προστίθεται σε μια στήλη σακχάρου άγαρ (δότης υδρογόνου) και η μικροβιακή καλλιέργεια ενοφθαλμίζεται με ένεση. Σε θετικές περιπτώσεις, το μικρόβιο που αναπτύσσεται σε ένα τέτοιο μέσο το αποχρωματίζει.

4. Προσδιορισμός του φάσματος των λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFA),Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί παράγουν ενδιάμεσα προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των λιπαρών οξέων και των αλκοολών βραχείας αλυσίδας, το φάσμα (προφίλ) των οποίων είναι διαφορετικό σε διαφορετικούς τύπους μικροοργανισμών και επιτρέπει την αναγνώριση μικροοργανισμών στο επίπεδο του γένους. Τα πιο συχνά ελεγμένα είναι τα οξικά, προπιονικά, βουτυλικά, ισοβουτυλικά, βαλερικά, ισοβαλερικά, καπροϊκά και ισοκαπροϊκά οξέα. Για τον προσδιορισμό των SCFAs, χρησιμοποιείται η μέθοδος χρωματογραφίας αερίου-υγρού. Εντοπίζονται μικροοργανισμοί όπως ακτινομύκητες, προλιονοβακτήρια, ευβακτήρια, διφιδοβακτήρια και κλωστρίδια.

Τα τελευταία χρόνια, βακτηριολογικά εργαστήρια έχουν χρησιμοποιήσει εμπορικά συστήματα δοκιμών για ταχεία βιοχημική ταυτοποίηση (καθορισμός της βιοχημικής δραστηριότητας διαφορετικών ομάδων μικροοργανισμών): για παράδειγμα, δοκιμές 2O για εντεροβακτήρια και δοκιμές ZO για αναερόβια. Το σύστημα αναγνώρισης περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα:

Αποικίες ---- Προετοιμασία ---- Εφαρμογή ----- Επώαση ---- Μέτρηση (+ -) ---- Δια-

αναστολές αναστολές 4 ώρες 37°C παρουσίαση την Τετάρτη

Ως υλικό αναγνώρισης χρησιμοποιείται μια καλά απομονωμένη αποικία σε ένα τρυβλίο ή μια καθαρή καλλιέργεια σε δοκιμαστικό σωλήνα, από την οποία παρασκευάζεται ένα εναιώρημα στη συγκέντρωση του προτύπου οπτικής πυκνότητας N4 και στη συνέχεια προστίθενται 55 μl του εναιωρήματος στα φρεάτια. με τα μέσα αυτού του συστήματος δοκιμής. Η πλάκα με τις λωρίδες επωάζεται στους 37°C για 4 ώρες. Η λογιστική μπορεί να πραγματοποιηθεί αυτόματα (χρησιμοποιώντας τη συσκευή ATV) ή οπτικά Το αποτέλεσμα μιας βιοχημικής αντίδρασης αξιολογείται με τη μορφή «+» ή «-» και εισάγεται ένας πίνακας αναφοράς στον οποίο ένα θετικό αποτέλεσμα αντιστοιχεί σε μια αριθμητική έκφραση. , με αποτέλεσμα ένα συγκεκριμένο αριθμητικό προφίλ που αντιστοιχεί σε ένα ειδικά αναπτυγμένο αναλυτικό ευρετήριο προφίλ που σας επιτρέπει να προσδιορίζετε γρήγορα το ένα ή το άλλο

μικροοργανισμός.

77288 0

Πολιτιστικές ιδιότητες βακτηρίων

Οι πολιτιστικές (ή μακρομορφολογικές) ιδιότητες περιλαμβάνουν χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ανάπτυξης μικροοργανισμών σε στερεά και υγρά θρεπτικά μέσα. Στην επιφάνεια των πυκνών θρεπτικών μέσων, ανάλογα με τη σπορά, μπορούν να αναπτυχθούν μικροοργανισμοί με τη μορφή αποικιών, ραβδώσεων ή συνεχούς χλοοτάπητα.

Μια αποικία είναι μια απομονωμένη συλλογή κυττάρων του ίδιου τύπου που αναπτύχθηκε από ένα κύτταρο (κλώνος κυττάρων). Ανάλογα με το πού αναπτύσσεται ο μικροοργανισμός (στην επιφάνεια ενός πυκνού θρεπτικού μέσου ή στο πάχος του), διακρίνονται οι επιφανειακές, οι βαθιές και οι αποικίες πυθμένα.

Οι αποικίες που αναπτύσσονται στην επιφάνεια του μέσου είναι ποικίλες: είναι ειδικές για τα είδη και η μελέτη τους χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του είδους της υπό μελέτη καλλιέργειας.

Κατά την περιγραφή των αποικιών, λαμβάνονται υπόψη τα ακόλουθα χαρακτηριστικά:
1) το σχήμα της αποικίας - στρογγυλό, αμοιβοειδές, ριζοειδές, ακανόνιστο κ.λπ.

2) μέγεθος (διάμετρος) της αποικίας - πολύ μικρό (αιχμηρό) (0,1-0,5 mm), μικρό (0,5-3 mm), μεσαίο (3-5 mm) και μεγάλο (διάμετρος μεγαλύτερη από 5 mm).

3) η επιφάνεια της αποικίας είναι λεία, τραχιά, διπλωμένη, ζαρωμένη, με ομόκεντρους κύκλους ή ακτινωτά ραβδωτά.

4) προφίλ αποικίας - επίπεδο, κυρτό, σε σχήμα κώνου, σε σχήμα κρατήρα κ.λπ.

5) διαφάνεια - θαμπό, ματ, γυαλιστερό, διαφανές, πούδρα.

6) χρώμα της αποικίας (χρωστική ουσία) - άχρωμο ή χρωματισμένο (λευκό, κίτρινο, χρυσό, κόκκινο, μαύρο), σημειώστε ιδιαίτερα την απελευθέρωση της χρωστικής στο μέσο με τον χρωματισμό του.

7) άκρη της αποικίας - λεία, κυματιστή, οδοντωτή, με κρόσσια κ.λπ.

8) δομή αποικίας - ομοιογενής, λεπτόκοκκη ή χονδρόκοκκη, ραβδωτή. Η άκρη και η δομή της αποικίας προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας μεγεθυντικό φακό ή σε χαμηλή μεγέθυνση μικροσκοπίου, τοποθετώντας ένα τρυβλίο Petri με τον ενοφθαλμισμό στο τραπέζι του μικροσκοπίου με το καπάκι προς τα κάτω.

9) συνέπεια της αποικίας. καθορίζεται αγγίζοντας την επιφάνεια με βρόχο: η αποικία μπορεί να είναι πυκνή, μαλακή, να μεγαλώνει σε άγαρ, βλεννώδης (εκτείνεται πίσω από τον βρόχο), εύθραυστη (σπάει εύκολα όταν έρχεται σε επαφή με τον βρόχο).

Οι βαθιές αποικίες μοιάζουν συνήθως με περισσότερο ή λιγότερο πεπλατυσμένες φακές (οβάλ σχήμα με μυτερά άκρα), μερικές φορές σβώλους βαμβακιού με εκφύσεις σαν νήματα στο θρεπτικό μέσο. Ο σχηματισμός βαθιών αποικιών συνοδεύεται συχνά από ρήξη του πυκνού μέσου εάν οι μικροοργανισμοί απελευθερώνουν αέριο.

Οι κάτω αποικίες συνήθως μοιάζουν με λεπτές διαφανείς μεμβράνες που απλώνονται κατά μήκος του πυθμένα.

Τα χαρακτηριστικά της αποικίας μπορεί να αλλάξουν με την ηλικία εξαρτώνται από τη σύνθεση του μέσου και τη θερμοκρασία καλλιέργειας.

Η ανάπτυξη μικροοργανισμών σε υγρά θρεπτικά μέσα λαμβάνεται υπόψη χρησιμοποιώντας καλλιέργειες τεσσάρων έως επτά ημερών που αναπτύσσονται υπό σταθερές συνθήκες.

Σε υγρά θρεπτικά μέσα, με την ανάπτυξη μικροοργανισμών, παρατηρείται θολότητα του μέσου και σχηματισμός φιλμ ή ιζήματος.

Όταν αναπτύσσονται σε ημι-υγρό (0,5-0,7% άγαρ) θρεπτικά μέσα, τα κινητά μικρόβια προκαλούν έντονη θολότητα, οι ακίνητες μορφές αναπτύσσονται μόνο κατά τη σπορά με έγχυση στο μέσο.

Συχνά η ανάπτυξη μικροβίων συνοδεύεται από την εμφάνιση οσμής, τη μελάγχρωση του περιβάλλοντος και την απελευθέρωση αερίων. Η χαρακτηριστική οσμή των καλλιεργειών ορισμένων τύπων βακτηρίων σχετίζεται με το σχηματισμό διαφόρων εστέρων (οξικός αιθυλεστέρας, οξικός αμυλεστέρας κ.λπ.), ινδόλης, μερκαπτάνης, υδρόθειο, σκατόλη, αμμωνία, βουτυρικό οξύ.

Η ικανότητα σχηματισμού χρωστικών είναι εγγενής σε πολλούς τύπους μικροοργανισμών. Η χημική φύση των χρωστικών είναι ποικίλη: καροτενοειδή, ανθοκυανίνες, μελανίνες. Εάν η χρωστική ουσία είναι αδιάλυτη στο νερό, μόνο η καλλιέργεια πλάκας λερώνεται. εάν είναι διαλυτό, χρωματίζεται και το θρεπτικό μέσο. Πιστεύεται ότι οι χρωστικές προστατεύουν τα βακτήρια από τις βλαβερές επιδράσεις του ηλιακού φωτός, γι 'αυτό υπάρχουν τόσα πολλά βακτήρια με χρώμα στον αέρα, επιπλέον, οι χρωστικές ουσίες εμπλέκονται στο μεταβολισμό αυτών των μικροοργανισμών.

Στη φύση, υπάρχουν τα λεγόμενα φωσφορίζοντα βακτήρια, οι καλλιέργειες των οποίων λάμπουν στο σκοτάδι με ένα πρασινωπό-μπλε ή κιτρινωπό φως. Τέτοια βακτήρια βρίσκονται κυρίως στο νερό του ποταμού ή της θάλασσας. Τα φωτεινά βακτήρια - φωτοβακτήρια - περιλαμβάνουν αερόβια βακτήρια (vibrios, κόκκοι, ράβδοι).

Απομόνωση καθαρών καλλιεργειών μικροοργανισμών

Μια καθαρή καλλιέργεια είναι μια καλλιέργεια που περιέχει μικροοργανισμούς του ίδιου είδους. Η απομόνωση καθαρών καλλιεργειών βακτηρίων είναι ένα υποχρεωτικό στάδιο βακτηριολογικής έρευνας στην εργαστηριακή πρακτική, στη μελέτη της μικροβιακής μόλυνσης διαφόρων περιβαλλοντικών αντικειμένων και γενικά σε οποιαδήποτε εργασία με μικροοργανισμούς.

Το υπό μελέτη υλικό (νερό, έδαφος, αέρας, τρόφιμα ή άλλα αντικείμενα) συνήθως περιέχει ενώσεις μικροβίων.

Η απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας καθιστά δυνατή τη μελέτη των μορφολογικών, πολιτιστικών, βιοχημικών, αντιγονικών και άλλων χαρακτηριστικών, το σύνολο των οποίων καθορίζει το είδος και τον τύπο του παθογόνου, δηλαδή γίνεται η αναγνώρισή του.

Για την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών μικροοργανισμών, χρησιμοποιούνται μέθοδοι που μπορούν να χωριστούν σε διάφορες ομάδες:
1. Μέθοδος Παστέρ - διαδοχική αραίωση του υλικού δοκιμής σε υγρό θρεπτικό μέσο στη συγκέντρωση ενός κυττάρου στον όγκο (έχει ιστορική σημασία).

2. Μέθοδος Koch ("καλωδίωση πλάκας") - διαδοχική αραίωση του υλικού δοκιμής σε τετηγμένο άγαρ (θερμοκρασία 48-50 C), ακολουθούμενη από έκχυση σε τρυβλία Petri, όπου το άγαρ στερεοποιείται. Οι εμβολιασμοί γίνονται, κατά κανόνα, από τις τελευταίες τρεις ή τέσσερις αραιώσεις, όπου τα βακτήρια γίνονται λίγα και αργότερα, καθώς αναπτύσσονται σε τρυβλία Petri, εμφανίζονται απομονωμένες αποικίες, που σχηματίζονται από ένα αρχικό μητρικό κύτταρο. Από απομονωμένες αποικίες στα βάθη του άγαρ, λαμβάνεται μια καθαρή καλλιέργεια βακτηρίων με υποκαλλιέργεια σε φρέσκα μέσα.

3. Μέθοδος Shukevich - χρησιμοποιείται για τη λήψη καθαρής καλλιέργειας Proteus και άλλων μικροοργανισμών με «έρπουσα» ανάπτυξη. Το υλικό δοκιμής εμβολιάζεται σε νερό συμπύκνωσης στη βάση της κλίσης άγαρ. Τα κινητά μικρόβια (Proteus) είναι σε θέση να ανεβαίνουν στο λοξό άγαρ, οι ακίνητες μορφές παραμένουν για να αναπτυχθούν κάτω, στο σημείο της σποράς. Με την επανασπορά των άνω άκρων της καλλιέργειας, μπορείτε να αποκτήσετε μια καθαρή καλλιέργεια.

4. Μέθοδος Drigalsky - χρησιμοποιείται ευρέως στη βακτηριολογική πρακτική, κατά την οποία το υλικό που μελετάται αραιώνεται σε δοκιμαστικό σωλήνα με αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα ή ζωμό. Μια σταγόνα υλικού προστίθεται στο πρώτο φλιτζάνι και απλώνεται στην επιφάνεια του μέσου χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη γυάλινη σπάτουλα. Στη συνέχεια, με την ίδια σπάτουλα (χωρίς να το κάψει στη φλόγα του καυστήρα) γίνεται η ίδια σπορά στη δεύτερη και τρίτη κούπα.

Με κάθε ενοφθαλμισμό βακτηρίων, όλο και λιγότερο παραμένει στη σπάτουλα και, κατά τη σπορά στο τρίτο φλιτζάνι, τα βακτήρια θα κατανεμηθούν στην επιφάνεια του θρεπτικού μέσου χωριστά το ένα από το άλλο. Μετά από 1-7 ημέρες διατήρησης των πιάτων σε θερμοστάτη (ανάλογα με τον ρυθμό ανάπτυξης των μικροοργανισμών), στο τρίτο πιάτο, κάθε βακτήριο παράγει έναν κλώνο κυττάρων, σχηματίζοντας μια απομονωμένη αποικία, η οποία υποκαλλιεργείται σε λοξό άγαρ για να συσσωρευτεί. έναν καθαρό πολιτισμό.

5. Μέθοδος Weinberg. Ιδιαίτερες δυσκολίες προκύπτουν κατά την απομόνωση καθαρών καλλιεργειών υποχρεωτικών αναερόβιων. Εάν η επαφή με το μοριακό οξυγόνο δεν προκαλεί αμέσως κυτταρικό θάνατο, τότε η σπορά πραγματοποιείται σύμφωνα με τη μέθοδο Drigalsky, αλλά μετά από αυτό τα πιάτα τοποθετούνται αμέσως σε αναερόστατο. Ωστόσο, η μέθοδος αναπαραγωγής χρησιμοποιείται συχνότερα. Η ουσία του έγκειται στο γεγονός ότι η αραίωση του υπό μελέτη υλικού πραγματοποιείται σε λιωμένο και ψυχόμενο στους 45-50 oC θρεπτικό μέσο άγαρ.

Γίνονται 6-10 διαδοχικές αραιώσεις, στη συνέχεια το μέσο στους δοκιμαστικούς σωλήνες ψύχεται γρήγορα και η επιφάνεια καλύπτεται με ένα στρώμα μείγματος παραφίνης και βαζελίνης για να αποτραπεί η διείσδυση αέρα στο πάχος του θρεπτικού μέσου. Μερικές φορές το θρεπτικό υλικό, μετά τη σπορά και την ανάμειξη, μεταφέρεται σε αποστειρωμένους σωλήνες Burri ή τριχοειδείς πιπέτες Παστέρ, των οποίων τα άκρα σφραγίζονται. Με επιτυχή αραίωση, μεμονωμένες αποικίες αναερόβιων αναπτύσσονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, σωλήνες Burri και σιφώνια Παστέρ. Για να διασφαλιστεί ότι οι απομονωμένες αποικίες είναι καθαρά ορατές, χρησιμοποιούνται διαυγασμένα θρεπτικά μέσα.

Για να εξαχθούν απομονωμένες αποικίες αναερόβιων, ο σωλήνας θερμαίνεται ελαφρά περιστρέφοντάς τον σε φλόγα, ενώ το άγαρ δίπλα στα τοιχώματα λιώνει και το περιεχόμενο του σωλήνα με τη μορφή στήλης άγαρ γλιστρά έξω σε ένα αποστειρωμένο τρυβλίο Petri. Η στήλη άγαρ κόβεται με αποστειρωμένα τσιμπιδάκια και οι αποικίες αφαιρούνται με θηλιά. Οι εκχυλισμένες αποικίες τοποθετούνται σε υγρό μέσο ευνοϊκό για την ανάπτυξη απομονωμένων μικροοργανισμών. Το μέσο άγαρ διοχετεύεται έξω από τον σωλήνα Burri περνώντας το αέριο μέσα από ένα βαμβακερό βύσμα.

6. Μέθοδος Hungate. Όταν θέλουν να αποκτήσουν απομονωμένες αποικίες βακτηρίων με ιδιαίτερα υψηλή ευαισθησία στο οξυγόνο (αυστηρά αερόβια), χρησιμοποιείται η μέθοδος περιστρεφόμενου σωλήνα Hungate. Για να γίνει αυτό, το τετηγμένο μέσο άγαρ εμβολιάζεται με βακτήρια με σταθερό ρεύμα μέσω ενός δοκιμαστικού σωλήνα αδρανούς αερίου που ελευθερώνεται από ακαθαρσίες οξυγόνου. Στη συνέχεια, ο σωλήνας σφραγίζεται με ένα ελαστικό πώμα και τοποθετείται οριζόντια σε ένα σφιγκτήρα που περιστρέφει τον σωλήνα. το μέσο κατανέμεται ομοιόμορφα στα τοιχώματα του δοκιμαστικού σωλήνα και στερεοποιείται σε ένα λεπτό στρώμα. Η χρήση ενός λεπτού στρώματος σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα γεμάτο με ένα μείγμα αερίων επιτρέπει σε κάποιον να αποκτήσει απομονωμένες αποικίες που είναι καθαρά ορατές με γυμνό μάτι.

7. Απομόνωση μεμονωμένων κυττάρων με χρήση μικροχειριστή. Ο μικροχειριστής είναι μια συσκευή που σας επιτρέπει να αφαιρέσετε ένα κελί από ένα εναιώρημα χρησιμοποιώντας μια ειδική μικροσιφώνια ή μικροβρόχο. Αυτή η λειτουργία ελέγχεται με μικροσκόπιο. Στη σκηνή του μικροσκοπίου τοποθετείται ένας υγρός θάλαμος, μέσα στον οποίο τοποθετείται το κρεμαστό παρασκεύασμα σταγόνας. Οι μικροπιπέτες (μικροπομπές) στερεώνονται στις βάσεις των κερκίδων λειτουργίας, η κίνηση των οποίων στο οπτικό πεδίο του μικροσκοπίου πραγματοποιείται με ακρίβεια micron χάρη σε ένα σύστημα βιδών και μοχλών. Ο ερευνητής, κοιτάζοντας μέσα από ένα μικροσκόπιο, αφαιρεί μεμονωμένα κύτταρα με μικροπιπέτες και τα μεταφέρει σε σωλήνες που περιέχουν ένα αποστειρωμένο υγρό μέσο για να αποκτήσει έναν κυτταρικό κλώνο.

L.V. Timoschenko, M.V. Τσούμπικ

Εάν, με βάση ορισμένα συμπτώματα στα φυτά και τα αποτελέσματα της μικροσκοπικής εξέτασης, υπάρχει υποψία ότι ο αιτιολογικός παράγοντας της νόσου είναι ένα βακτήριο, το επόμενο βήμα θα πρέπει να είναι η απομόνωσή του.

Σε αυτή την περίπτωση, θεωρείται ότι το παθογόνο είναι μολυσμένο με συνοδούς οργανισμούς, δηλαδή υπάρχει μικτός πληθυσμός. Για να ληφθεί το παθογόνο με τη μορφή χωριστής αναπτυσσόμενης αποικίας, το εμποτισμένο ιστό θα πρέπει να τοποθετηθεί σε ραβδώσεις στο μέσο.

Σπορά με ένα άγγιγμα. Χρησιμοποιώντας έναν πυρωμένο βρόχο εμβολιασμού, πάρτε μια μικρή ποσότητα εμποτισμένου φυτικού ιστού που περιέχει βακτήρια και, με ελαφριές κινήσεις, χωρίς να καταστρέψετε την επιφάνεια του άγαρ, εφαρμόστε 4-6 κινήσεις στο προετοιμασμένο θρεπτικό μέσο. Έχοντας ξαναπυρώσει τη θηλιά, το κύπελλο με το μέσο στρέφεται κατά 90° προς τα δεξιά και στη συνέχεια εφαρμόζονται άλλες 4-6 πινελιές από τη δεύτερη διαδρομή, η βελόνα πυρώνεται ξανά και γίνεται η τρίτη σπορά. Αυτό επιτυγχάνει μια αραίωση του υλικού έναρξης έτσι ώστε τα βακτήρια, μετά από επώαση σε θερμοστάτη για 48-72 ώρες στους 28 °C, να σχηματίζουν μεμονωμένες αποικίες διαφόρων σχημάτων και χρωμάτων. Οι αποικίες στη συνέχεια μεταφέρονται σε λοξούς σωλήνες άγαρ για περαιτέρω εξέταση. Χρησιμοποιώντας ένα φρυγμένο βρόχο, πάρτε μια αποικία και εφαρμόστε την σε θρεπτικό άγαρ με μια προσεκτική κίνηση με τη μορφή φιδιού ή ζιγκ-ζαγκ.

Μέθοδος έκχυσης Koch. Η μέθοδος πλάκας Koch διασφαλίζει ότι κάθε αποικία σχηματίζεται από ένα μόνο βακτηριακό κύτταρο. Είναι καλύτερο να προετοιμάσετε ένα εναιώρημα από το αρχικό υλικό σε αποστειρωμένο νερό και να χρησιμοποιήσετε τη μέθοδο Koch μόνο με αυτή την αραίωση. Μια μικρή ποσότητα του εναιωρήματος μεταφέρεται στον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα με ένα θρεπτικό μέσο ψυγμένο στους 60 °C. Στη συνέχεια, το περιεχόμενο του σωλήνα αναμιγνύεται με το εμβόλιο περιστρέφοντάς το μεταξύ των παλάμων. Στη συνέχεια, πάρτε έναν δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα, ανοίξτε τον προσεκτικά πάνω από τη φλόγα του καυστήρα και χρησιμοποιήστε μεγάλους βρόχους για να μεταφέρετε τρία μέρη του υποστρώματος σε αυτόν από τον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα. Μετά το ψήσιμο του λαιμού και του πώματος, το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα χύνεται στο πρώτο τρυβλίο Petri, ανοίγοντας το καπάκι του πιάτου ίσα-ίσα ώστε να εισαχθεί ο λαιμός του δοκιμαστικού σωλήνα κάτω από αυτό. Αμέσως μετά την έκχυση, κλείστε το φλιτζάνι και μοιράστε προσεκτικά το θρεπτικό μέσο ομοιόμορφα.

Αφού αναμείξετε καλά τα περιεχόμενα του δεύτερου δοκιμαστικού σωλήνα, πάρτε έναν τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα και μεταφέρετε έξι μέρη του υποστρώματος από το δεύτερο σε αυτόν με ένα βρόχο. Το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα χύνεται σε ένα κύπελλο και το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα, μετά την ανάμειξη, χύνεται στο κύπελλο. Τα πιάτα με το μέσο επωάζονται σε θερμοστάτη στους 28°C, μετά από μερικές ημέρες, τα βακτήρια που περιέχονται στο αρχικό υλικό σχηματίζουν αποικίες.

Σειριακή αναπαραγωγή. Εάν, για παράδειγμα, είναι απαραίτητο να απομονωθούν βακτήρια από το έδαφος, τότε χρησιμοποιείται σειριακή αραίωση. Αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο (15 ml ανά φλιτζάνι) χύνεται σε κύπελλα, 0,1 ml από τις τρεις τελευταίες αραιώσεις του εναιωρήματος εφαρμόζεται στο σκληρυμένο άγαρ και απλώνεται στην επιφάνεια με μια γυάλινη σπάτουλα.

Για την απομόνωση βακτηρίων, 1 g χώματος εναιωρείται σε 9 ml νερού, ανακινείται καλά, αφήνεται να κατακαθίσει για λίγα δευτερόλεπτα και παρασκευάζονται σειριακές αραιώσεις από το εναιώρημα. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, μπορεί να προσδιοριστεί ο αριθμός των μικροοργανισμών σε κάθε δείγμα.

Εάν βρείτε κάποιο σφάλμα, επισημάνετε ένα κομμάτι κειμένου και κάντε κλικ Ctrl+Enter.

Σε μια σειρά διαδοχικών δεκαπλάσιων αραιώσεων του δείγματος δοκιμής από τις τελευταίες 2 αραιώσεις (ο βαθμός αραίωσης εξαρτάται από τον αριθμό των CFU σε 1 δόση του υπό δοκιμή φαρμάκου), 0,1 ml του μικροβιακού εναιωρήματος σπέρνεται σε τρυβλία Petri με θρεπτικό συστατικό. μέτριο (2 φλιτζάνια για κάθε αραίωση). Το εναιώρημα κατανέμεται ομοιόμορφα στην επιφάνεια του μέσου χρησιμοποιώντας σπάτουλα Drigalski ή γυάλινες χάντρες έως ότου το εναιώρημα απορροφηθεί πλήρως (στεγνό). Τα πιάτα καλύπτονται και τοποθετούνται ανάποδα σε φούρνο επώασης.

Οι καλλιέργειες επωάζονται σε θερμοκρασία (37  1) o C για 24–96 ώρες σε κατάλληλες συνθήκες, ανάλογα με τον τύπο του μικροοργανισμού (αερόβιο, μικροαερόφιλο ή αναερόβιο). Κατά την επώαση υπό αναερόβιες ή μικροαερόφιλες συνθήκες, τα τρυβλία Petri με καλλιέργειες τοποθετούνται σε αναερόστατο και δημιουργείται η απαραίτητη ατμόσφαιρα αερίου.

Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του αριθμού των ζωντανών βακτηρίων κάθε είδους σε προβιοτικά πολλαπλών συστατικών, υπό την προϋπόθεση ότι τα βακτήρια που περιλαμβάνονται στο παρασκεύασμα σχηματίζουν αποικίες που διακρίνονται οπτικά ως προς το σχήμα και άλλα χαρακτηριστικά.

1.2. Μέθοδος βαθιάς κούπας

Σε μια σειρά διαδοχικών δεκαπλάσιων αραιώσεων του δείγματος δοκιμής από τις τελευταίες 2 αραιώσεις (ο βαθμός αραίωσης εξαρτάται από τον αριθμό των CFU στο παρασκεύασμα δοκιμής), 1,0 ml μικροβιακού εναιωρήματος προστίθεται σε τρυβλία Petri με διάμετρο 90 mm χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα χωρητικότητας 1,0 ml (2 φλιτζάνια για κάθε αραίωση). Προσθέστε 20–25 ml λιωμένου και ψυχθέντος σε θερμοκρασία 42,5 ± 2,5 o C θρεπτικό μέσο άγαρ, κλείστε και γρήγορα ανακατέψτε προσεκτικά με περιστροφικές και μεταφορικές κινήσεις, χωρίς να σηκώσετε το κάτω μέρος του φλιτζανιού από την επιφάνεια του τραπεζιού και να αποτρέψετε το να πάρει το μέσο στο καπάκι του φλιτζανιού. Αφού στερεοποιηθεί το άγαρ, τα τρυβλία Petri αναποδογυρίζονται και επωάζονται υπό κατάλληλες συνθήκες σε θερμοκρασία (37  1) o C για το χρόνο που απαιτείται για τον συγκεκριμένο μικροοργανισμό.

Λογιστική για τα αποτελέσματα

Στο τέλος της επώασης, μετρώνται οι αποικίες που αναπτύσσονται σε τρυβλία Petri και υπολογίζεται η περιεκτικότητα σε ζωντανά βακτήρια σε 1 δόση του δείγματος δοκιμής. Κατά την καταμέτρηση, λήφθηκαν υπόψη οι πλάκες στις οποίες αναπτύχθηκαν τουλάχιστον 15 αποικίες.

Παράδειγμα υπολογισμούπεριεκτικότητα ζωντανών μικροβιακών κυττάρων σε 1 δόση του δείγματος δοκιμής:

– από αραίωση 10 -7, αναπτύχθηκαν 42 και 45 αποικίες. ο αριθμητικός μέσος όρος είναι (42+45): 2 = 43,5;

– από αραίωση 10 -6, αναπτύχθηκαν 410 και 450 αποικίες. ο αριθμητικός μέσος όρος είναι (410+450) : 2 = 430;

– ο αριθμός των ζωντανών βακτηρίων σε 1 δόση είναι ίσος με:

(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .

Πολλαπλασιάστε τον αριθμητικό μέσο όρο του αριθμού των αποικιών με το βαθμό αραίωσης και, εάν η σπορά σε ένα τρυβλίο Petri γίνεται σε όγκο 0,1 ml, πολλαπλασιάστε με έναν παράγοντα 10 για να μετατραπεί σε 1,0 ml.

Μέθοδος περιοριστικών αραιώσεων ακολουθούμενη από σπορά σε υγρά και ημί-υγρά θρεπτικά μέσα

Μέθοδος δοκιμαστικού σωλήνα των πιο πιθανών αριθμών (καθορισμός του αριθμού των ζωντανών γαλακτοβακίλλων acidophilus)

Σε μια σειρά διαδοχικών δεκαπλάσιων αραιώσεων του δείγματος δοκιμής 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 (ο βαθμός αραίωσης εξαρτάται από τον αριθμό των CFU στο δείγμα δοκιμής), 1 ml μικροβιακού εναιωρήματος από κάθε αραίωση εμβολιάζεται σε 2 δοκιμαστικούς σωλήνες με 9 ml αποστειρωμένου γάλακτος χωρίς λιπαρά. Σημειώνεται από ποια αραίωση έγινε η καλλιέργεια. Μια αραίωση 10 -6 του φαρμάκου σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9% αντιστοιχεί σε αραίωση 10 -6 στο γάλα. Για τον έλεγχο του μέσου, προσθέστε 4 μη εμβολιασμένους δοκιμαστικούς σωλήνες με γάλα. Οι ενοφθαλμισμένοι σωλήνες και οι σωλήνες ελέγχου επωάζονται σε θερμοκρασία (38  1) 0 C για 3–4 ημέρες.

Στο τέλος της επώασης, προσδιορίζεται ο αριθμός των δοκιμαστικών σωλήνων με πηγμένο γάλα. Παρασκευάζονται επιχρίσματα από τον καλλιεργημένο θρόμβο και χρωματίζονται με Gram. Εάν στα επιχρίσματα είναι ορατά χαρακτηριστικά βακτήρια και δεν υπάρχει ξένη μικροχλωρίδα, τότε αυτή η αραίωση λαμβάνεται υπόψη ότι περιέχει μικροοργανισμούς αυτού του τύπου. Στην περίπτωση ζύμωσης γάλακτος σε σωλήνες ελέγχου και εάν ανιχνευθεί ξένη μικροχλωρίδα σε επιχρίσματα, ο έλεγχος πραγματοποιείται σε νέα παρτίδα θρεπτικού υλικού.

Λογιστική για τα αποτελέσματα

Κατά τον υπολογισμό του αριθμού των ζωντανών ατόμων, χρησιμοποιήστε τον πίνακα McCready (Πίνακας 1). Αρχικά, συντάσσεται ένα αριθμητικό χαρακτηριστικό. Αποτελείται από 3 αριθμούς: στην πρώτη θέση (στα αριστερά) βάλτε έναν αριθμό ίσο με τον αριθμό των δοκιμαστικών σωλήνων με πηγμένο γάλα που ελήφθησαν στην τελευταία αραίωση όπου το γάλα είχε πήξει σε όλους τους δοκιμαστικούς σωλήνες (για παράδειγμα, 2 δοκιμαστικοί σωλήνες αραίωση 10 -6).

Οι επόμενοι δύο αριθμοί υποδεικνύουν τον αριθμό των δοκιμαστικών σωλήνων με πηγμένο γάλα σε 2 διαδοχικές αραιώσεις (για παράδειγμα, σε 1 δοκιμαστικό σωλήνα αραίωσης 10 -7 και σε 1 δοκιμαστικό σωλήνα αραίωσης 10 -8).

Το αριθμητικό χαρακτηριστικό του αποτελέσματος θα είναι 211.

Χρησιμοποιώντας τον πίνακα McCready, βρείτε τον πιθανό αριθμό που αντιστοιχεί στο ληφθέν ψηφιακό χαρακτηριστικό (στην περίπτωσή μας, 13), πολλαπλασιάστε το με την αραίωση, που αντιστοιχεί στο πρώτο ψηφίο του αριθμητικού χαρακτηριστικού (σε αυτό το παράδειγμα, 10 -6). Τότε ο αριθμός των ζωντανών μικροοργανισμών σε 1 δόση είναι 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7.

Πίνακας 1 - Πίνακας McCready που χρησιμοποιείται κατά τον υπολογισμό του αριθμού των ζωντανών γαλακτοβακίλλων οξεόφιλων

Αριθμητικό χαρακτηριστικό	Ο πιο πιθανός αριθμός μικροοργανισμών όταν ενοφθαλμιστεί σε 2 παράλληλους σωλήνες